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恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1羧基端编码基因真核表达重组克隆的构建 |
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s study provides a good basis for us to find out an effective P.f erythroc
ytic stage nucleic acid vaccine .The protective immune response to the
se vaccines will be studied in the future.
【 Subject words 】 Nucleic acid vaccine Merozoite surface prot
ein 1 Gene expression Plasmid Plasmodium falciparum
1993年R G Webster首次用含有流感病毒血凝素基因的真核表达质粒直接免疫动物
后，诱发出明显的保护性免疫，此后核酸疫苗在其它感染性疾病研究中亦取得可喜结果〔1〕。
近年来的研究表明：核酸疫苗具有能引起明显的细胞免疫反应；体内真核天然表达，不需纯化
等繁琐工作；以及制备、携带方便，廉价等优点，故有人称核酸疫苗的问世是第三次疫苗革
命〔2〕。疟疾疫苗仅有关于约氏疟红前期核酸疫苗的报道〔3〕。作者选择了恶性疟原虫红
内期抗原——裂殖子表面蛋白1(MSP1)的羧基端片段基因(即15～17区基因，其编码4200
0蛋白)作为核酸疫苗的外源基因，进行核酸疫苗的构建。
材料与方法
1.质粒与菌株：pUC18/MSP1-42(FUP株),其具体构建见另文，简单地讲，设计一对引
物，
P1(Forward)5-CGGTCGAC ATGTTAAACAT TTCACAACACC-3
SalⅠ 起始码
P2(Reverse)5-GCGGATCC TTATAAGAAGT TAGAGGAACTG-3
BamHⅠ 终止码
正向引物含SalⅠ酶切位点和起始码，反向引物含BamHⅠ酶切位点和终止码，从恶性疟原虫F
UP株PCR扩增出MSP1的15～17区基因片段，有1126bp，以SalⅠ和BamHⅠ双酶切将该
基因片段克隆入pUC18中，测序鉴定其序列完全正确。
VR1012(美国Hoffman惠赠)含巨细胞病毒早期启动子和BGH多聚A尾和卡那霉素抗性基
因的真核表达质粒，为非分泌型真核表达载体。将信号肽基因TPA插入VR1012的多克隆位
点前使其改建为分泌型真核表达载体VR1012/TPA，同时突变和增加了某些酶切位点〔4〕(图
1)。
图1 VR1012和VR1012/TPA基因结构和多克隆位点简图
Fig 1. Gene construct and poly clone sites of VR1012 and VR1012/TPA
2.重组载体的构建：pUC18/MSP1-42(FUP株)用Sal Ⅰ和BamHⅠ限制酶进行双酶切，
低温点琼脂糖凝胶回收约1100bp片段，将回收片段与经相同酶切的VR1012和VR1012/T
PA连接，将连接产物转化氯化钙制备的新鲜感受态细胞JM109菌，转化产物涂于含卡那霉素
的LB培养板，37℃过夜培养后，挑取若干菌落扩大培养，提取质粒。进行如下工作。
3.重组载体的PCR鉴定：以提取的质粒为模板，用扩增分子量为42000基因片段的引物
进行PCR，PCR 条件为94℃变性1分钟，72℃ 3分钟的两温点法，共循环30次，PCR产物进
行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR反应体系为Promega公司产品，引物为中国科学院上海生
物工程研究中心合成。
4.重组载体的酶切鉴定：将PCR鉴定的阳性克隆用SalⅠ和BamHⅠ限制性内切酶进行双
酶切，酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
结 果
1.pUC18/MSP1-42经SalⅠ和BamHⅠ限制酶进行双酶切后的结上一页 [1] [2] [3] 下一页
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