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种探找超抗原T细胞识别表位的新方法 |
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主
要与T细胞结合〔5〕，我们选择了TSST-1的第125位至158位序列作为合成肽(T34肽)的序
列，另合成一个十肽(C10肽)作为对照：
T34肽： NH2-AISTLDFEIRHQLTQIHGLYRSS
DKTGGYWKITM-COOH
C10肽： NH2-GNIYDIAAQV-COOH
2.主要试剂：固相多肽合成的成套试剂购自美国的PE公司，抗人CD28的抗体(小鼠IgG)
由美国Bristol-Meyers Squibb Pharmaceutical Research Institute的Ledb
etter博士惠赠，羊抗鼠IgG抗体(用于交联CD28抗体)购自华美生物工程公司。
3.多肽合成：用9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成法，在Applied Biosystems 431A多
肽合成仪上进行；选择4-羟甲基苯氧甲基-共聚苯乙烯-1%二乙烯苯(HMP)树脂为固相载体：合
成肽反应用二环已基碳二亚胺(DCC)/1-羟基苯骈三唑(HOBt)法；肽链从C端向N端延伸；肽-
树脂产物的后处理按本室常规方案进行；粗肽经C8反相高效液相层析(HPLC)柱纯化后，用氨
基酸分析仪对其组成进行分析。
4.人外周血单个核细胞(PBMC)分离：分别取6个健康成年人的外周血，行Ficoll-Hyp
aque密度梯度离心，分离得到PBMC。
5.人PBMC的增殖反应检测：实验组用完全的RPMI 1640培养液调整人的PBMC浓度至3
×106个/ml，以200μl/孔的量加到96孔细胞培养板内，然后在有或无10μg/ml抗人CD
28抗体和23μg/ml的羊抗鼠IgG(用以交联CD28抗体)的协同下，分别加入4种浓度的T34
肽；对照组：除用C10肽替代T34肽，其余同实验组。培养72小时后，用3 H-TdR掺入法检测。
结 果
人PBMC对单纯4种浓度的T34肽的刺激，均未表现出增殖反应(P＞0.05)(图1)。但
是，当加入CD28抗体后，即在CD28分子共刺激辅助下，人PBMC对1μmol/L以上浓度T34
肽的刺激，表现出增殖反应，且呈浓度依赖关系(P＜0.01)(图2)。
图1 人PBMC对T34肽刺激的反应
Fig 1. Response of human PBMC to T34 peptide
图2 在CD28分子共刺激辅助下人PBMC对T34肽刺激的反应
Fig 2. Response of human PBMC to T34 peptide plus CD28 costimulation
讨 论
目前对蛋白质抗原T细胞识别表位的研究多采用合成肽技术〔６〕，即通过合成一系列对
应于抗原分子一级结构的多肽分子，观察其对T细胞的刺激作用来确定T细胞识别表位的确切位
置。抗原活化T淋巴细胞，需要抗原提呈细胞(APC)的辅助，唯有与APC膜的MHC相结合的抗
原分子方可获得APC的辅助。换言之，抗原与MHC分子结合是抗原活化T细胞的先决条件〔7
〕。所以用合成肽方法探找T细胞识别表位，首先要确保合成的肽段内有MHC结合位存在。否
则，即使合成肽内含有T细胞识别表位，也因无MHC结合位而无法探及。
超抗原与MHC分子结合的形式颇为特别，它无需象普通抗原一样要经过APC内处理加工
成小肽的形式与MHC分子结合，而是直接以完整蛋白质的形式与MHC分子结合〔8〕。因此，
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