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细胞性一氧化氮供体的建立及其对肿瘤细胞凋亡的诱导效应 |
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即可克服上述缺点，使之更接近于生理状态。传统的NO细胞供体的制备方法是
将静止细胞用细胞因子刺激后使之获得暂时的生成NO能力〔4〕。无疑这种方法亦具有较大
的局限性。为了克服这一缺点，我们在研究NO对凋亡的诱导效应过程中建立一种能稳定地合
成诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)的细胞系，并能稳定产生NO特异性终产物亚硝酸盐。本工作
采用这种NO供体成功地证实NO能促进Sp2/0细胞的自发凋亡。
材料与方法
1.试剂：Dowex 50w-X8阳离子交换树脂、L-Arg、NADPH、FMN、BH4、EGTA、PM
SF、leupetin、钙调蛋白(CaM)、盐酸萘乙胺、磺胺、Tris碱、氯化钙、L-NAME，购于
Sigma公司；L-〔2、3、4、5，-3 H〕-Arg(比活为2.37TBq/mmol)购于Amersham公司
；硝酸纤维素膜购于BioRad公司；胎牛血清、RPMI 1640购于Gibco-BRL公司；其它常
用化学试剂为国产分析纯试剂。
2.细胞培养：Sp2/0骨髓瘤细胞系用5% FCS、RPMI 1640培养基(含卡那霉素50μg/m
l,25mmol/L HEPES)37℃、5% CO2培养。
3.亚硝酸盐的检测：参照文献〔6〕，取100μl细胞培养上清加入等体积的Griess试
剂(1%磺胺、0.1%萘乙胺、2.5%H2PO4)，5～10分钟内测定吸光度A550值。
4.NOS活性测定：采用3 H-胍氨酸转 换法〔7，6〕进行NOS活性测定。首先制备活性测定混
合液：2mmol/L B-NADPH、2μmol/L BH4、10μmol/L FAD、10μmol/L FMN、0.
5mmol/L CaCl2、15nmol/L CaM、10μmol/L L-Arg、16mmol/L Tris·Cl pH7.4、
4μl/ml L-〔2、3、4、5- 3 H〕-Arg。测定时取上述混合液50μl与等量样品混合，37℃孵
育1小时，加入400μl终止液(2mmol/L EDTA、2mmol/L EGTA、40mmol/L HEPES,p
H5.5)。将每一反应液分别上样于Dowex 50w-X8柱(1ml柱体积、Tris碱预平衡至pH7.0
～7.5)。用1ml终止液洗脱，将1.5ml洗脱物加入10ml闪烁液(环氧六环/POP/POPOP)
中，分别测定各管的放射性强度，阳性对照为小鼠脑匀浆，阴性对照为样品缓冲液(50mmol
/L Tris·Cl,pH7.5,0.5mmol/L EDTA,0.5mmol/L EGTA,1mmol/L DTT,1μmo
l/L BH4,10μg/ml leupeptin/1mmol/L PMSF)。阴性对照的放射性计数应小于总放
射性的2%。
5.DNA片段的提取及凝胶电泳：参照文献〔9，10〕。
6.凋亡细胞的DAPI染色：将细胞悬液涂片，用2.5%戊二醛固定5～10分钟，小心去除
固定液并加入数滴DAPI染色液(1μg/ml)染色、洗片、晾干。在荧光显微镜下观察结果。详
细步骤参见文献〔9〕。
7.Western blot分析：常规SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维素膜上，经洗涤，用抗i
NOS的特异性抗体(兔源性IgG,效价为1∶5000)37℃孵育4小时，洗涤后用HRP酶标羊抗兔
IgG(1∶2000)，最后用ECL发光法进行显色(按Gibco-BRL公司的产品说明书进行)。实验
中，我们选用的iNOS特异性抗体为本室制备，相应免疫抗原为iNOS N端1～196AA的重组
片段，与美国西南医学中心Kim S Lau所采用的抗原相同，抗体的特异性亦完全相同(潘英等,
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