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单抗5C5 |
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ly positive in staining with the McAb. Conclusions
1)It is suggested that 5C5 cDNA and HSMRP17 mRNA are not the same; 2)The e
xpression of the differentiation antigen recognized by the McAb is cha
nging during B cell differentiation.
【 Subject words 】 5C5 cDNA Antibody,monoconal B cell membr
ane Microscopy
5C5-G1是我们实验室制备的一个单克隆抗体，流式细胞仪分析显示，在所检测的细
胞中，它识别的蛋白质表达于活化B细胞〔１〕。用单抗5C5-G1作探针，从一个人扁桃体细
胞λgt11 cDNA文库筛选到了一个613bp长的cDNA〔2〕。在筛选编码单抗5C5-G1所识别的分化抗
原的全长cDNA的同时，我们对GenBank中的资料进一步作了同源性比较，发现我们的cDN
A序列中的2～450bp与一个由Fort P投送的1008bp cDNA中的560～1008bp高度同源。
后者在GenBank中的登记号为X79865，称为H.sapiens Mrp17 mRNA。它编码的蛋白质
表达于纤维细胞株CCL39的G1期。免疫荧光染色和亚细胞成分分析表明，它编码的蛋白质主
要位于线粒体，而在细胞膜则无表达〔3〕。鉴于我们的cDNA与H.sapiens Mrp17 mRNA
间的高度同源性，有必要检测它们编码的蛋白是否相关，我们以往实验中尽管观察到单抗5C
5-G1识别的蛋白质在细胞膜上，但流式细胞仪检测的是活细胞，单抗只能与细胞膜上的蛋白
质反应，而不能穿过胞膜进入胞内，从而不可能观察到胞浆中是否也存在着它识别的蛋白质。
因此我们作了固定细胞的间接免疫荧光染色，用激光扫描共聚焦显微镜对荧光染色情况作了
断层扫描，进一步确认单抗5C5-G1识别的分化抗原表达于B细胞胞膜。
材料与方法
1.细胞株：人活化B细胞株3D5为本室所建〔4〕。人前B淋巴瘤细胞株Nalm-6为中国医
学科学院沈德诚教授所赠。人B淋巴瘤细胞株Daudi和EB病毒转化的B淋巴细胞株SKW6冻存
于本实验室。所有细胞均于含10%新生牛血清的RPMI 1640液中培养传代。
2.间接免疫荧光染色：方法参见参考文献〔5〕。培养细胞用PBS离心洗涤2次，1500
r/min 5分钟/次。悬细胞于适量PBS中。滴置细胞悬液于载玻片上，于室温经电吹风吹干。
用4%多聚甲醛固定15分钟，PBS淋洗3次。滴加用PBS适当稀释的单抗5C5-G1腹水，用相
同稀释度的Sp2/0作对照，置湿盒37℃ 30分钟。PBS淋洗3次。滴加用PBS作适当稀释的F
ITC-羊抗小鼠IgG(Sigma),置湿盒中37℃ 30分钟。PBS淋洗3次后，甘油封片。
3.激光扫描共聚焦显微镜观察：用激光扫描共聚焦显微镜(Ultima212,美国Meridia
m公司)观察细胞荧光染色情况。选取单个荧光染色阳性细胞作断层扫描，扫描厚度为0.5μ
m。
4.免疫组化染色：方法参照文献〔5〕。人新鲜扁桃体组织石蜡包埋。切片厚5μm，脱
蜡，水化，浸泡于蒸馏水中。置切片于含0.3% H2O2的甲醇中，37℃ 30分钟。切片经自来水和
蒸馏水淋洗后，用含0.1%的胰酶和0.1% CaCl2的PBS 37℃消化30分钟。用蒸馏水淋洗后P
BS中连续浸泡3次，每次10分钟。用正常羊血清于37℃封闭组织25分钟。滴加用PBS作适
当稀释的5C5-G1单抗腹水，对照用相同比例稀释的Sp2/0腹水。置湿盒4℃过夜。用PBS淋
洗4次，每次5分钟。加生物素标记的亲和素(北京中山生物技术公司)，置湿盒4℃过夜。加辣
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