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人重组C3片段通过IL |
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起重要的作用。C3经C3转化酶活化后产生
C3b，经I因子和H因子作用产生iC3b,它含有与CD11b/CD18结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸
(RGD)序列〔1〕。CD11b/CD18分子即补体受体3(CR3)，属于β2整合素家族，在炎症过程起重要作用，
最近发现其还参与细胞因子的免疫调节，起到信号传导的作用〔2〕。为深入研究C3的结构与
功能，本室曾在大肠杆菌表达成功iC3b上含有RGD序列的功能区(简称C33)，证明其具有C
R3结合活性，发现其能够降低小鼠内毒素休克动物模型的死亡率〔3〕。在本文C33的功能
研究中，进一步发现了C33对小鼠杀伤性细胞株CTLL细胞具有促增殖作用，并证明这一作用
是由于促进了IL-2的自分泌效应。
材料与方法
1.质粒与菌株：pSL-C33质粒为本室构建的C33大肠杆菌表达质粒〔3〕；pop2136为
大肠杆菌C600衍生菌株，含CI 857基因，可温控pSL-C33质粒的表达，由Raiband 博士
惠赠。pcD-mIL-2质粒为小鼠IL-2表达质粒〔4〕，用作杂交探针。
2.重组小鼠IL-2：利用本室构建的小鼠IL-2表达质粒pMIL-228在大肠杆菌表达经变性
复性后用作阳性对照〔4〕。
3.细胞株：CTLL-2细胞：小鼠杀伤T细胞株，依赖IL-2生长。
4.抗体：抗小鼠IL-2的多克隆抗体，亲和提纯的羊抗小鼠抗体，购自Santa Cruz生物
技术公司；抗小鼠CD11b的单克隆抗体，蛋白G亲和提纯的大鼠单抗，购自Pharmingen公
司。
5.C33的纯化：按本室方法大批量诱导表达重组C33，超声裂解细菌，C33部分以不溶
性包涵体的形式存在，部分游离存在于超声上清中。将包涵体经洗液洗涤3次，去除部分细菌
膜蛋白。用8 mol//L尿素，20mmol/L 2-巯基乙醇变性，37℃水浴，1小时。12000r/m
in离心10分钟，去除不溶性杂质，50mmol/L Tris-HCl pH8.5扩大体积稀释8倍复性，
经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱纯化，FPLC测定蛋白纯度。
6.C33对CTLL-2细胞的促增殖活性：收获IL-2维持生长的CTLL-2细胞用Hanks液洗
涤3次，去除IL-2。用含5%胎牛血清的RPMI1640培养液将细胞配成浓度105细胞/ml，加
入96孔培养板中，每孔104细胞，并加入不同稀释度的C33，以MS2-HSA融合蛋白作为阴性
对照，37℃ 5% 二氧化碳孵箱培养48小时，MTT法检测细胞增殖情况。
7.抗体对C33的封闭效应研究：在上述C33活性研究中，在加入C33蛋白的同时，加入
1∶10稀释的抗体，测定抗体的封闭效应。阳性对照组利用小鼠IL-2刺激CTLL-2细胞。
8.C33对CTLL-2细胞IL-2 mRNA表达的影响：pcD-mIL-2质粒经BamHⅠ酶切后洗脱小
片段，按照DuPont NEN公司非同位素标记和杂交试剂盒说明书进行探针标记和狭缝杂交。
所用mRNA来自C33刺激，mIL-2刺激及去因子8小时的CTLL-2细胞，X-光片曝光观测结果。
所用杂交内对照为β-actin探针。
结 果
1.C33的纯化结果：经阴离子交换层析后，C33蛋白纯度在FPLC分析中可达98%以上(图
略)。
2.C33对CTLL-2细胞的促增殖活性：图1显示C33蛋白对IL-2依赖性细胞株CTLL-2细
胞具有明显的促增殖作用，并在1～20μg范围呈剂量依赖关系，阴性对照的MS2-HSA对CT
LL-2细胞无刺激作用。
图1 C33对CTLL-2细胞的刺激活性
Fig 1. Stimulating effect of C33 on the CTLL cells
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