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人亲环素A基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 |
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穿蛋白峰即为纯化的rhCyPA。PPIase活性鉴定采用糜蛋白酶偶联法。
结果与讨论
1.引物设计与合成：编码CyPA的基因及其对应的氨基酸顺序见文献〔3〕。为了用RT-
PCR方法从人细胞总RNA中扩增这一基因片段并为以后克隆与表达的需要，设计了一对引物
PRI-A1和PRI-A2，分别在两引物中引入EcoRⅠ、NdeⅠ、HindⅢ、BamHⅠ酶切位点，
并将起始后的第二密码子GTC改为大肠杆菌偏爱的GTT。
2.CyPA cDNA 的PCR扩增及序列测定：以设计合成的两个寡核苷酸片段(PRI-A1，PRI-
A2)为引物，通过35个循环的双温PCR，得到了525bp的扩增产物。初步鉴定后的PCR产物
经EcoRⅠ和HindⅢ酶切，用T4连接酶与M13载体连接，转化大肠杆菌JM103菌株，挑取
白斑菌落，提取噬菌体RF DNA，再经PCR鉴定阳性后进行核酸序列分析。结果表明，克隆的
cDNA片段除引物设计中的一个C改为T外，其余序列均与已报道的人CyPA基因序列完全一致。
3.CyPA表达载体的构建：测序证实无误的CyPA cDNA片段用NdeⅠ、BamHⅠ双酶切，
经纯化后连接到载体pET11c中，构建表达载体pET11/CyPA,转化大肠杆菌BL21(DE3)。
选择培养得到的阳性菌提取质粒作为模板，再用PRI-A1和PRI-A2引物进行PCR扩增，得到
525bp特异性DNA扩增带。为了确证外源基因的存在，用NdeⅠ、BamHⅠ对重组质粒pET
11/CyPA进行双酶切鉴定，得到预期的DNA片段。
4.重组质粒在大肠杆菌中的表达：pET11/CyPA质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)经IP
TG诱导后作SDS-PAGE分析，分子量为18×103处出现一浓染的蛋白质条带，与rhCyPA标
准品分子量相同。经扫描计算CyPA的量占菌体可溶性蛋白的41%。
5.表达产物的纯化及PPIase活性测定：表达载体转化菌经超声波裂解，硫酸铵沉淀，
再经DEAE Sepharose CL-6B柱层析，便得到纯度达95%以上的rhCyPA(见附图)，并显示
出PPIase活性。
附图 pET11/CyPA转化大肠杆菌表达产物的SDS-PAGE分析
1.蛋白质分子量标准；2.未诱导的培养物；3.诱导2小时的培养物；4.纯化的表达产物；
5.CyPA标准品
参 考 文 献
1 Galat A and Metcalfe SM.Peptidylproline cis/trans isomerase.Prog
Biophys molec Biol,1995,63∶67-118.
2 Kratz A,Harding MW,Craft J, et al. Autoantibodies against cyclophi
lin in systemic lupus erythematosus and lyme disease.Chin Exp Immuno,
1992,90∶422-427.
3 Haedler B and Hofer E.Characterization of the human cyclophilin gen
e and of related processed pseudogenes.Eur J Biochem,1990,190∶477-4
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