|
苯丙氨酸对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞内钙的影响 |
| |
［6］大鼠(SHR)和WKY的主动脉VSMC为材料，观察苯丙氨酸对VSMC外钙内流和细胞内游离钙浓度(［Ca2＋］i)的影响，进一步从细胞水平探索苯丙氨酸抑制SHR的血管平滑肌细胞增生的作用机制。
材料与方法
1.试剂：Fura-2/AM、Triton-X-100、EGTA和L-苯丙氨酸均为美国Sigma公司产品(分析纯)。PSS1液(mmol/L)：取NaCl 140、KCl 5、CaCl2 1、葡萄糖10、MgCl2 1、Hepes 20，依次溶于800 mL三蒸水中。以Tris溶液调pH值至7.4，加水至1 000 mL。PSS2溶(mmol/L)：取NaCl 95、KCl 5、CaCl2 1、葡萄糖10、MgCl2 1、Hepes 20,依次溶于800 mL三蒸水中，以Tris溶液调pH值至7.4，加水至1000 mL。MLB终止反应液(mmol/L)：MgCl2 10、LaCl3 10，Hepes 10依次溶于800 mL三蒸水中。以Tris溶液调pH值至7.4，加水至1 000 mL。［45CaCl2］购自美国Amersham公司(3.7×1010Bq/L)。液闪计数器为Bio-Rad公司产品，荧光分光光度计为美国Beckman公司产品，8周龄SHR由上海市高血压研究所动物室提供。
2.SHR和WKY主动脉VSMC培养和平滑肌细胞钙内流的测定：参照Campbell和Smith的方法操作［7，8］。将WKY和SHR的VSMC细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔5×104个。加入DMEM培养液，常规条件培养至呈融合状态。使细胞进入G0期，之后，加入苯丙氨酸使达到既定浓度。培养12 h。届时，吸弃培养液，每孔用1 mL PSS1冲洗两次。加入PSS2 1 mL，置培养箱平衡30 min后，加入37×103 Bq［45CaCl2］(空白孔不加)后于培养箱中30 min取出，快速倾弃上述液体，将培养板迅速置于碎冰上，加入预冷的MLB液1 mL终止钙的内流。5 min后，以MLB液将每孔清洗两次。以0.2%胰蛋白酶消化细胞，弃消化液，加入0.5 mL无钙镁的Hanks液，使细胞充分分散并计数每一孔的细胞总数，将细胞收集于0.22 μm的醋酸纤维滤膜上，1 mL PBS洗膜3次，6%(W/V)三氯醋酸1 mL冲洗3次，无水乙醇1 mL冲洗3次，80℃烘干2 h。置于液闪瓶中，加入0.5% PPO二甲苯溶液6 mL，盖紧瓶盖，放置过夜，测CPM(counts.min-1)值。
3.SHR和WKY主动脉VSMC内游离钙的测定：参照Grynkie的方法操作［9］。如上将与苯丙氨酸温育12 h的VSMC取出，弃培养液，加入0.5 mL无钙镁的Hanks液洗涤6次。之后，加入含钙(1 mmol/L)的PSS2作为温育液，同时加入5 mmol/L的Fura-2/AM使终浓度为5 μmol/L,30 min后取出弃液，以0.2%胰蛋白酶消化细胞。激发光栅10 nm，发射光栅16 nm，发射光波长500 nm，激发光波长在340 nm处时说明Fura-2/AM进入细胞并由其分解出的Fura-2与Ca2＋结合，固定激发波长于340 nm分别测定细胞在基础状态下和不同浓度苯丙氨酸作用后细胞的荧光强度，最后加入0.1% Triton-X-100测Fmax和 3 mmol/L的EGTA测Fmin,根据公式计算细胞内游离钙浓度。
［Ca2＋］i=KD(F-Fmin)/(Fmax-F)。
结果
1.苯丙氨酸可以抑制细胞外钙进入SHR的VSMC内的量，且与苯丙氨酸浓度呈反相关。而对WKY的VSMC无影响，如图1。
Fig 1 Effect of phenylalanine (Phe) on cellular calcium
influx from the extracellular in VSMC of SHR
图1 苯丙氨酸对SHR的VSMC的细胞外钙内流的影响
2.苯丙氨酸可以减少细胞内游离钙的总量，随苯丙氨酸浓度的增大，细胞内［Ca2＋］i减少；而对WKY的VSMC无影响，如图2。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导离体兔肺动脉反应性变化的影响
下一个医学论文： 高血压无左室肥厚患者舒张功能改变的观察
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文