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bax 加强表达促进鼻咽癌细胞CNE2株凋亡 |
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分化鳞癌细胞株［2］经体外多年传代后，细胞中仍有EBV基因存在，包括EBNA1，LMP1和EBERs基因等。其中潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP1)可引起上皮细胞发生恶性转化［3］。LMP1蛋白在30%～65%的鼻咽癌中可检测到。Bcl-2作为一种促进细胞生存的蛋白，通常也伴随LMP1一起出现在EBV阳性的鼻咽癌细胞中［4］。Lu等认为bcl-2和LMP1的共表达可能在EBV相关的上皮细胞转化过程中起着互补作用［5］。1993年发现的Bax蛋白是一种促进细胞凋亡的蛋白，并可抑制肿瘤的发生，它与bcl-2形成异二聚体并自身形成同二聚体可拮抗bcl-2的作用［6］。
本研究将baxα基因导入CNE2细胞使其加强表达以观察它拮抗bcl-2的程度和对CNE2细胞凋亡的效应。
材料与方法
一、材料来源：
1.质粒pSFFV-baxα-neo由本研究室构建［9］。
2.细胞株：人低分化鼻咽癌细胞株CNE2，由中山医科大学肿瘤防治中心提供。
3.酶及主要试剂：DOTAP脂质体转染试剂盒，购自德国宝灵曼公司：兔抗人Bax抗体，美国Dako产品；FITC-羊抗兔IgG，胎牛血清购自北京天象人公司；禽源性(AMV)逆转录酶，RNasin，Taq酶为美国promega公司产品。
二、方法：
1.细胞培养及凋亡的诱导：CNE2细胞培养于RPMI1640+10%胎牛血清(fetal calf serum, FCS)培养液中，5% CO2，37℃贴壁培养，按常规方法，隔天胰酶消化、分瓶，传代培养，待细胞长至7成满，用于转染。RPMI1640不加FCS诱导CNE2细胞凋亡48 h后，收集细胞。
2.基因转染：参照试剂盒说明书制备质粒DNA与DOTAP混合溶液；0.25%胰酶消化7成满CNE2细胞数分钟，加入5 mL培养液，吹打成单个细胞，与DNA/DOTAP混合液混匀，置CO2培养箱中保温6 h，用新鲜的含G418 250 μg/mL选择培养液置换原培养液，保温细胞过夜。3～7 d换1次选择培养基，1周后改用125 μg/mL G418维持常规培养。
3.RT-PCR：参照文献［7］，收集5×106细胞抽提细胞总RNA以Oligo(dT)15为引物合成第一条cDNA， 进一步PCR，热循环条件为94℃变性2 min，再经94℃ 40 s，60℃ 60 s， 70 ℃ 40 s。共30 次循环，以β-actin作为内参照。
4.间接免疫荧光检测法：参照文献［5］，转染后的细胞传代时，将洁净消毒的盖玻片置于培养皿中与传代细胞一起培养过液，第2 d取出长满细胞的盖玻片，PBS洗1次，-10℃甲醇固定5 min，空气中干燥，1.5%牛血清白蛋白的PBS保温标本20 min，一抗(兔抗人Bax抗体0.1 μg/mL)37℃保温60 min，PBS洗3次，每次5 min。FTTC-羊抗兔IgG的二抗保温(10μg/mL) 45 min，PBS洗3次，荧光显微镜观察，拍照记录。
5.流式细胞仪及琼脂糖凝胶电泳细胞凋亡：250 g离心收集培养细胞，约1×105个制成单细胞悬液，PBS洗3次，70%冷乙醇固定，4℃保存过夜，1%碘化丙锭染色30 min，流式细胞仪检测，激光波长488 nm；琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡方法参照文献［8］。
6.统计处理用χ2检验。
结果
一、重组质粒pSFFV-baxα-neo导入CNE2细胞：
脂质体转染法将baxα cDNA导入CNE2细胞，以导入空载质粒pSFFV-neo的CNE2-Vec为对照，筛选1周后，第10 d长出独立的具有新霉素抗性的CNE2克隆。
二、RT-PCR在mRNA水平检测baxα的表达暨阳性克隆的鉴定：
1.转染前检测CNE2细胞中baxα的表达：抽提CNE2细胞总RNA，RT-PCR扩增的电泳结果(见图1a)，图中所示，培养的CNE2细胞mRNA水平检测不到baxα的表达。
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