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遗传工程微生物细胞间发生的自然遗传转化 |
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，不仅能用PCR、转化等技术直接检测到自然环境中胞外DNA的存在，而且这些DNA分子可因与固型物（土壤、沙子、水底沉积物等）结合而得到保护，免受DNase的降解，并在较长时间内保持其生物学活性〔4,5〕。而这些胞外DNA除了由于细胞裂解或死亡所释放外，还有不少是一些细菌在生长的特定阶段向胞外主动释放所致〔3,6,7〕。Stewart等对施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）自然转化的研究又进一步表明，在不加外源游离DNA的情况下，转化不仅可在完整的供体和受体细胞间直接进行，而且细胞间的接触大大促进转化活性，从而提出自然转化过程的进行可能并非完全仅取决于受体细胞，供体细胞也在一定程度上起着某种积极的作用〔8〕。对包括DNA主动分泌及通过细胞间接触促进转化过程进行等在内的DNA供体功能的研究已成为自然转化研究的一个新的发展方向〔1,3〕。本文对携带重组基因的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在人工培养的条件下不同菌株之间发生的质粒DNA和染色体DNA的细胞间自然遗传转化进行了初步的研究，获得了十分有意义的结果。这不仅有可能对安全合理使用和构建GEMs提供理论依据，而且对于揭示自然遗传转化的生物学实质也将具有重要意义〔9～11〕。
1 材料与方法
1.1 菌种和质粒
枯草芽孢杆菌BG2036（Δapr 684 ΔnprE22，Kms）、DB104 (his-nprR2 nprE18 ΔaprA3，Kms)，均为本实验室保存；pPR8是以pUB110（Kmr）〔12〕为载体插入嗜麦芽假单胞菌（P.maltophilia）的蛋白酶基因得到的重组质粒，由本实验室构建。
1.2 培养基
LB培养基(％)：胰蛋白胨1.0，酵母粉0.5，NaCl 0.5，pH 7.2；Spizizen基本培养基（SpMM）(％)：葡萄糖0.5，MgSO4．7H2O 0.02，(NH4)2SO4 0.2，K2HPO4 1.4，KH2PO4 0.6，柠檬酸钠．2H2O 0.1。其中MgSO4、葡萄糖单独灭菌，冷却后再混合。
固体培养基另加琼脂粉至1.5％。
LM固体培养基：LB固体培养基另加脱脂牛奶粉至1.5％。
卡那霉素（Km）的使用终浓度为50μg/ml，组氨酸（His）的使用终浓度为50μg/ml。
1.3 细菌间进行的自然遗传转化
将BG2036、DB104/pPR8两菌株分别接种于SpMM、SpMM（Km＋His）液体培养基中，培养至对数生长后期，各取250μl新鲜菌液混合于Eppendorf管中，振荡数秒混匀（DNaseI敏感性试验对照组在此时加入终浓度为100μg/ml的DNaseI），37℃静置1h,振荡数秒混匀,取100μl涂布于SpMM（Km）平板上，37℃培养36h后进行转化子检测和计数，同时分别取上述二菌株菌液稀释后涂布于SpMM、SpMM（Km＋His）、SpMM（Km）平板上，进行供体和受体的活菌计数以及选择平板敏感性对照。
1.4 质粒的检测
参照Hardwood等的方法〔12〕，将小量煮沸法略有改进，即通过此法获得含有质粒DNA的上清后以饱和酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）溶液抽提一次，经无水乙醇沉淀后，溶于20μl TE Buffer中，取15μl上样电泳。
1.5 产蛋白酶活性的平板检测
将待测菌株的单菌落点种于LM平板上，37℃培养24h后观察透明圈的产生情况。
2 结果和讨论
2.1 细菌间发生的自然遗传转化
枯草芽孢杆菌是一类重要的基因工程受体菌，它在生长过程中可以以主动分泌或被动裂解的方式向胞外释放具有转化活性的质粒DNA和染色体DNA，并且它还可以建立自然感受态〔13〕，因此我们选取了两株具有不同遗传标记的枯草芽孢杆菌作为出发菌株进行细菌细胞间自然遗传转化的研究。Lorenz等人的研究发现，枯草芽孢杆菌在寡营养条件下比在营养丰富的条件下更容易建立自然感受态，感受态的高峰出现在对数生长后期，并且此时也恰恰是具有转化活性的DNA的分泌高峰〔13〕。为了证明处于对数生长期的枯草杆菌能够在不加外源转化DNA的条件下进行细胞间自然转化，我们将菌株BG2036（原养型，Kms）、DB104/pPR8（his－，Kmr）分别接种于SpMM、SpMM（Km＋His）液体培养基之中，培养至对数生长后期，然后再将二者混合静置培养。实验结果表明，将混上一页 [1] [2] [3] 下一页
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