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PCNA等5种基因在小鼠睾丸发育过程中的表达 |
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细胞的增殖。生殖细胞的发育过程也存在细胞的生长和分化过程，那么这些基因的作用是否与这一过程中的细胞生长调控有关，本研究检测了PCNA、cdc2、cyclin D1、P16负调控基因在生殖细胞发育中的作用。
1 材料与方法
1.1 生物学材料
1.1.1 小鼠卵巢
实验用昆明种小白鼠，购于中科院昆明动物所。
睾丸组织 分别取自于出生1日龄、30日龄和成年（3个月）鼠的睾丸组织（各取5只）。
1.1.2 重组质粒
质粒pBR322购于北京东方公司；P16基因重组质粒、P21基因重组质粒、PCNA基因重组质粒、cdc2基因重组质粒和cyclin D1基因重组质粒均由美国冷泉港实验室Beach博士赠送。
1.2 实验方法
图1 5种基因在鼠睾丸发育过程中的表达
1A、1B、1C分别示1日龄、30 日龄和成年鼠睾丸组织中PCNA基因的表达； 2A、2B、2C分别示1日龄、30 日龄和成年鼠睾丸组织中cyclin D1基因的表达；3A、3B、3C分别示1日龄、30 日龄和成年鼠睾丸组织的中cdc2基因的表达；4A、4B、4C分别示1日龄、30 日龄和成年鼠睾丸组织的中P21基因的表达；5A、5B、5C分别示1日龄、30 日龄和成年鼠睾丸组织的中P16基因的表达。
1.2.1 组织切片及探针制备
小鼠断颈处死后取睾丸组织，10％中性甲醛固定，常规石蜡包埋。切片厚9μm，用甘油蛋白粘片剂贴于预先用APES（3－氨基丙基三乙氧基硅烷）处理过的载玻片上，37℃温育24小时后，室温干燥备用。
质粒转化、扩增及抽提按常规方法〔7〕操作。
DNA片段分离：取P16、P21、PCNA、cdc2、cyclin D1基因的重组质粒DNA各6μg，分别按0.2 U/μgDNA加限制性内切酶及相应的缓冲液8 μl（P16：用EcoRI和XhoI；P21：用SacI和XbaI；PCNA：用SacI和XbaI；cdc2：用EcoRI；cyclin D1：用EcoRI）。再用消毒三蒸水调总体积达到80μl，37℃恒温过夜。酶切产物用0.8％的低溶点琼脂糖回收各基因cDNA片段，各取1μl与定量的标准DNA一起电泳，EB染色，根据其荧光强度估计各自的DNA含量。
将上述回收的基因cDNA各取1μg，沸水中变性10分钟。取出速置于冰浴中放置3分钟，然后顺序加入：混合六聚寡核苷酸引物2μl（hexamicleo tidemaxture），digoxigin 标记的dUTP 2μl，Klenow聚合酶1U，消毒四蒸水补充到总体积为20μl，37℃保温20小时，然后加2μl 0.2mol/L EDTA，2μl 4mol/L LiCl终止反应。－20℃无水乙醇（2.5倍）沉淀DNA，－20℃过夜。12 000r/min，离心20分钟，沉淀用50μl 1×TE溶解。
1.2.2 组织原位杂交
每一组杂交实验均分别随机取5张切片。具体杂交方法按文献〔8〕并稍加修改进行。
1.2.2.1 预处理 石蜡切片经二甲苯脱蜡两次，每次20分钟。用无水乙醇洗两次，每次10分钟。置空气中干燥，在2×SSC中常温浸泡20分钟。
1.2.2.2 预杂交 用消毒滤纸擦干组织切片周围的液体，但保持组织湿润。玻片置于6×SSC饱和的湿盒中，组织材料上加40～50μl预杂交液，42℃孵育4～5小时。
1.2.2.3 杂交 在预杂交液中加入适量的变性标记探针达最终浓度50ng/ml配制成杂交液，每张玻片上滴加40～50μl杂交液，42℃湿盒过夜。
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