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两种泥鳅中PdSox8和PdSox9的RFLP分析 |
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适量0.85％NaCl清洗至上清液无红色，再加入适量裂解液（0.5mol/L EDTA,0.5％SDS）震摇至出现粘状物；加入20μl浓度为10mg/ml的RNA酶于50℃消化过夜。经酚／酚·氯仿·异戊醇／氯仿·异戊醇抽提，冷乙醇沉淀及洗涤后置4℃干燥。加入适量TE，在紫外分光光度计上测定其纯度，电泳估计其分子量。
1.2.2 基因组DNA的限制性内切酶消化
选用两种限制酶EcoRI和HindIII,反应体积100μl,内含底物DNA约15μg,内切酶100单位,于37℃消化24h,取少量样品进行电泳检测待消化完全后,经酚／酚·氯仿·异戊醇／氯仿·异戊醇抽提一次,乙醇沉淀,70％乙醇漂洗,干燥后溶于20μl TE中备用。
1.2.3 Southern转移
参照萨姆布鲁克等著《分子克隆实验指南》〔4〕介绍的方法进行。在0.8％琼脂糖凝胶,室温0.8V/cm电压条件下电泳过夜，拍照并记录DNA分子量标记中各条带的位置。取出凝胶把上部1/3浸于0.2mol/L HCl中进行脱嘌呤处理10min;用去离子水充分漂洗。随后进行DNA的变性及中和处理。转移缓冲液为20×SSC；室温下转移DNA 18～24h。80℃烤膜2h；滤纸宽松包裹后置4℃备用。
1.2.4 放射性探针标记
按Gibco公司说明书。取纯化的PdSox8和Pd-Sox9基因片段各约400ng，100℃充分变性后，置于冰浴中速冷。依次加入d(GTP,ATP,TTP)混合液2μl(终浓度为0.5m mol/L),Klenow酶 2μl,50μ Ciα-32P-dCTP,补加水至20μl,混匀后于37℃标记3～12h。
1.2.5 Southern杂交
按0.2ml/cm2的量加入预杂交液(5×SSC,0.1％mol/L－lauroylasrcosine,0.02％SDS)于65℃预杂交3h以上。更换预杂交液.取标记好的探针100℃变性10min，迅速置于冰水浴中骤冷。吸取已变性探针加入杂交盒中于65℃杂交12～18h。在高严谨条件下洗膜。－20℃曝光7天。
1.2.6 DNA分子量计算
测量阳性杂交带距加样孔的距离，结合λ/HindIII分子量标记中各条带的电泳迁移距离，按下述公式计算其分子量：
lg(Y＋M)=a＋b lg(X＋N),其中Y为DNA片段大小（kb）,M为其修正值，X为电泳迁移距离，N为其修正值；b和a分别为方程的系数和常数。
2 结 果
泥鳅和大鳞副泥鳅各取6尾，其中雌雄各3尾。由于RFLP的检出与限制酶的选择有着极大的关系，我们根据人类中RFLP的分析资料，选择了在人类中可以产生丰富多态性的两种酶HindIII和EcoRI。基因组DNA样品经HindIII和EcoRI分别完全酶切后，用于Southern印迹杂交。整理后的结果列于表1、表2和表3。
表1 两种泥鳅中PdSox8 的RFLP分析（HindIII酶切）
材料与性别 杂交带及大小
大1♂ 4.2 0.7
大2♂ 4.2
大3♂ 4.2* 3.0 0.7
大4♀ 6.0 4.2
大5♀ 4.2
大6♀ 11.7 4.2 3.0 2.2 0.7
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