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中国鄂温克 鄂伦春 达斡尔族永生细胞系的建立与保存 |
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V液取自狨细胞株B95-8细胞株，由中国科学院遗传研究所提供。培养B95-8细胞至所需体积后，饥饿6～7天后，并反复冻融3次，收集于离心管中，2000r/min离心15min，将上清液用0.2μm滤膜，抽滤后分装1.2ml/管，－70℃保存。
1.3 转化实验
取外周血2～3ml，肝素抗凝，将血液与等量的RPMI1640培养液混均后，沿管壁渐渐加入到含有4ml已预热（37℃）的淋巴细胞分离液离心管中，混合血：淋巴细胞=6：4。3000r/min，离心20min。吸取白细胞层，移入另一支离心管中，加入10ml含1％双抗的RPMI1640进行洗涤，轻轻打匀，1200～1500r/min离心10min。弃上清，轻轻振荡试管底部，再加入10ml含1％双抗的RPMI1640，再离心，共洗涤3次。取2ml全培养液加入已洗涤3次的白细胞管内，加入1.2ml EBV液，0.4ml（0.2μg/ml）的环胞霉素A，充分混匀后移到两个10cm2的培养瓶中，置37℃培养箱。培养3～4天后，观察细胞转化情况，根据细胞转化和聚集及培养液pH改变的状况，进行加液或半量换液。约2周后，转化细胞明显增多，可见细胞成团，并且在显微镜下可见大量呈聚集生长的细胞团，此时可转入25cm2培养瓶中继续培养，培养液达50～60ml时，即可进行常规细胞冻存。
1.4 细胞的冻存和复苏
冻存液：95％的胎牛血清，5％的二甲基亚砜（DMSO）。抽滤灭菌，避光保存（－20℃）。在细胞株冻存前24小时加换一定量（5～7ml）的新鲜培养液，将细胞液收集至10ml离心管中，1200r/min离心10min，弃上清，根据细胞的数量加入一定量冻存液，分装在几支冻存管中，每管1ml冻存液。置－70℃冰箱过夜后，放入液氮中保存。细胞复苏时要迅速地将冻存管放入37℃水浴中，不停地晃动，见余有小冰团黄豆粒大小时放入超净工作台内，将细胞转入5ml全培养液的培养瓶中，置37℃温箱培养。24h后观察复苏细胞并加入培养液。
2 结果和讨论
采用上述方法，共建立永生细胞株140份，其中鄂温克族49份，鄂伦春族40份，达斡尔族51份。所有标本都在静置培养3～4天时，可见到转化的淋巴细胞，即淋巴细胞明显增大，胞质突出，形态各异，聚集成团的细胞株，建株的成功率在95％以上。所有建成的细胞系冻存后复苏的成功率为100％。经染色体G显带分析未见异常，表明建立细胞株的方法稳定。淋巴细胞是细胞遗传学及分子遗传学常用的研究材料，经EB病毒转化外周血B淋巴细胞，建立永生淋巴细胞系，可永久地保存有重要研究价值的个体的基因组，以保证今后不断的深入研究。EB病毒在体外可选择性地转化B淋巴细胞，但同时也能引起曾经感染过EB病毒者T淋巴细胞的免疫应答反应，从而攻击同一培养物中已被EB病毒感染的B淋巴细胞，导致转化的B淋巴细胞退化〔3〕。环孢霉素A是一种免疫抑制剂，能够在G0到G1期选择性地抑制T淋巴细胞RNA聚合酶Ⅱ的活性〔2〕，使T淋巴细胞失去了对EB病毒的免疫反应，从而有效地防止了已转化的B淋巴细胞因受到T淋巴细胞的攻击而退化。本实验中采用同时一次性加入环孢霉素A的方法，获得了满意的转化效率。研究表明，转化的白细胞的接种密度不宜过大，否则可能由于相对T淋巴细胞量增多，而有部分T淋巴细胞逃脱环孢霉素的抑制，以致攻击已转化的B淋巴细胞将其致死，正常建株时1～2ml全血分离的白细胞，环孢霉素用量为2μg/ml为宜。
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