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靶基因xylE质粒载体转基因小鼠的建立 |
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有效的载体回收［2］。由于质粒的回收不需抽提大片段的基因组DNA,不需体外包装,而且以质粒为载体对靶基因测序更为方便,因此制备以质粒为载体的转基因动物已成为毒理学研究的一个重要发展趋势。
本研究以pUC118NX质粒为载体,选用恶臭假单胞杆菌TOL质粒上的xylE( 邻苯二酚氧化酶基因)作为诱变靶基因,建立了基因组DNA中整合有pUC118NX质粒的C57BL/6J转基因小鼠模型。pUC118NX质粒全长4.12 kb,除带有xylE外,还带有乳糖操纵子调控序列lacOP和选择基因Ampr。xylE基因编码邻苯二酚氧化酶,该酶能使无色的邻苯二酚氧化成深黄色的2-羟基己酸半缩醛,故以pUC118NX质粒为载体的转基因小鼠模型不仅可以根据菌落黄白颜色不同来筛选突变子,还可以通过磁珠亲和吸附或酶切、环化等方法从小鼠基因组中回收该载体,使转基因小鼠致突变检测模型更为简便和实用。
材料与方法
一、材料
1．实验动物： C57BL/6J小鼠,1～3月龄,来自江苏省实验动物种子中心。
2．质粒和宿主菌: pUC118NX质粒和DH10B宿主菌由复旦大学遗传所毛裕民教授提供。
3．试剂:地高辛标记及检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司;PCR试剂盒购自上海生物工程有限公司; DNA纯化试剂盒来自QIAGEN公司;邻苯二酚购自江苏省张家港市南林溶剂厂;限制性内切酶及其他试剂主要来源于Promeger公司、MBI公司和华美生物工程公司。
二、方法
1.转基因小鼠的制备：
(1) 基因准备：感受态细胞的制备 、转化和碱裂解法制备质粒DNA均按照分子生物学常规方法进行。获得的pUC118NX质粒进行酶切鉴定和xylE功能鉴定。将结构和功能正确的pUC118NX 质粒用PstI酶切成线性,经DNA纯化试剂盒纯化后,用稀释液(8 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4; 0.2 mmol/L EDTA)稀释成1 μg/ml,-20℃保存备用。
(2)供体小鼠的超排和配种、受体小鼠的假孕、受精卵的回收、显微注射、移植与分娩均参见文献［3］方法进行。
2．转基因小鼠的鉴定：
(1)小鼠基因组DNA的提取： 剪取断乳仔鼠尾尖约1 cm，用蛋白酶K法［4］提取基因组DNA,溶于适量超纯水中,用电泳法确定DNA的浓度和纯度。
(2) 探针标记： pUC118NX质粒DNA经Hind Ⅲ酶切成线性后纯化,作为探针标记模板,用随机引物法(按地高辛标记试剂盒说明书所示方法进行)制备地高辛标记的探针。
(3)PCR-Southern分析：根据xylE基因序列设计合成一对能扩增500pb DNA片段的特异性引物,
P1：5′-TGAACAAAGGTGTAATGCGACCGGGCC-3′
P2：5′-TGAACAAAGGTGTAATGCGACCGGGCC-3′
50 μl PCR反应体系中含200 μmol/L dNTPs,1.5 mmol/L MgCl2,50 mmol/L Tris-HCl pH9.0,按95℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸1分种的参数进行35次循环。PCR反应产物经电泳及转膜固定后［5］，于42 ℃预杂交6小时（预杂交液含50%去离子甲酰胺、5×SSC、0.1% N-烷基肌氨酸、0.02% SDS和2% blocking reagent)，再加入探针于42℃杂交过夜。同时用质粒DNA和正常C57BL/6J小鼠基因组DNA分别作阳性和阴性对照。最后按地高辛检测试剂盒所列规程进行杂交信号检测。
(4) 载体回收及转化试验：PCR-Southern 杂交检测呈阳性小鼠的基因组DNA经Hind Ⅲ酶切后，取0.5 μg在400 μl反应体积中用0.5 U的T4DNA连接酶于16℃连接16小时,乙醇沉淀后溶于4 μl灭菌纯水中。上述回收载体用电穿孔法［6］转化DH10B宿主菌,随后将细菌涂于含适量Amp的LB平板,37℃培养过夜,喷洒0.5 mol/L邻苯二酚溶液后观察菌落显色情况。
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