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镉中毒诱发的自由基对红细胞损伤及带3蛋白表达的影响 |
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100稀释加入红细胞悬液，4℃ 12小时后，37℃ 1小时。0.05 mol/L TBS漂洗后再次用1%卵蛋白封闭20分钟，加入10 nm的胶体金37℃ 1～2小时，反应结束经0.05 mmol/L TBS漂洗后，用1%戊二醛固定10分钟，用硝酸银溶液放大免疫金约5分钟(金银复合颗粒的大小以反应时间控制)。详细操作步骤按文献［5］实施。随后1%锇酸固定1小时，乙醇系列脱水。日立HCP-2型临界点干燥仪干燥，Eiko，TB-5型溅射仪，离子镀膜7分钟。日立S-520扫描电镜观察。阴性对照：①略去胶体金；②以0.05 mol/L TBS替代抗体。其他步骤同扫描电镜样品制备。
结果
急性镉中毒实验，5例样本观察500个红细胞，几乎所有细胞均发生不规则变形。细胞膜表面除程度稍有差异外均有Ce与H2O2反应沉淀。图1为透射电镜观察镉中毒红细胞膜表面H2O2的反应标志。正常对照组，红细胞膜表面无反应沉淀物。经EDX分析，镉中毒红细胞，Cd测试峰的强度，膜上大于膜内区域。图2为点分析红细胞膜Cd能量失散谱Lα及Lβ。镉中毒实验组，带3蛋白的表达与正常红细胞相比均有明显减少。图3为急性镉中毒时红细胞带3蛋白的免疫金银标记物，伴有细胞的畸变。图4为正常红细胞呈圆盘状、规则，膜表面有大量带3蛋白的表达。阴性对照组，红细胞未见带3蛋白的表达。
图1 红细胞膜表面有密集的Ce-H2O2反应沉淀物×45 000
图2 EDX点分析红细胞膜Cd峰
图3 Cd中毒时畸变的红细胞，band3表达
呈弱阳性×6 000
图4 正常对照红细胞band3表达呈强阳性×6 000
讨论
红细胞在正常生理情况下产生少量自由基，血红蛋白结合氧，氧化后可释放超氧阴离子()。、H2O2、(羟自由基)的状态转变(毫秒或微秒即可完成)，此外血红蛋白被氧化、分解所产生的H2O2与形成有强烈活性的从而损伤蛋白，抑制某些酶类的活性，并引发脂质过氧化［6］。带3蛋白是细胞阴离子交换蛋白，也是红细胞膜主要含糖内在蛋白。带3蛋白整个分子可分，氨基端胞浆区和羟基端膜结合区多次贯穿于脂双层，并在膜的两侧各露出一段亲水肽段，在红细胞内外氯离子、碳酸氢离子交换，CO2的运输及其在肺排出过程中起重要作用［7，8］。带3蛋白与红细胞膜骨架(收缩蛋白、肌动蛋白和4.1蛋白等)通过锚蛋白连接成网架结构，以维持红细胞的正常形态及变形性。在识别和清除衰老红细胞方面，推测红细胞老化抗原可能是带3蛋白的降解产物。
在急性镉中毒时，应用铈离子捕捉红细胞产生的H2O2，形成具有电子密度的Ce(OH)3OOH或Ce(OH)2OOH反应沉淀物，进而能较精确反映自由基的产生情况。EDX分析及电镜结果提示：镉离子能诱发红细胞产生大量的H2O2，导致带3蛋白的自由基损伤，而影响其阴离子转运功能以及红细胞骨架的稳定性、变形性，导致细胞畸形。同时脂质的过氧化也将影响红细胞膜的流动性和通透性。自由基损伤可能是带3蛋白构象、抗原性等发生改变、导致表达明显减少的主要原因之一。从镉离子与细胞膜结合程度强于细胞内及H2O2生成部位情况推测，急性镉中毒所引起的红细胞损伤，可能以膜的自由基损伤为主。
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