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表达疟原虫裂殖子表面蛋白1减毒鼠伤寒杆菌的稳定性 |
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减毒鼠伤寒杆菌可被用作将外源抗原经口导入宿主免疫系统的载体，能有效地激发起宿主特异的免疫应答反应。恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1，MSP1)是红内期的重要候选抗原。我们已成功地将克隆有恶性疟原虫裂殖子MSP1第1号基因片段的pQE 质粒导入减毒鼠伤寒杆菌X4064 株中，构建成X4064(pQEM1) 重组菌，形成了组成型表达。在测试免疫效果之前，必须首先考察X4064(pQEM1) 的入侵能力，重组pQEM1 质粒在X4064株中的稳定性，以及重组菌的再表达能力，这些是能否激发起宿主免疫应答的先决条件。为此，使用X4064(pQEM1) 重组菌灌胃接种BALB/c 小鼠，鉴定从小鼠组织中分离到的该菌，测定其再表达能力，观察其在小鼠组织中的消长。
材料与方法
1．菌株、质粒和动物：重组减毒鼠伤寒杆菌X4064(pQEM1) 由本室构建，减毒鼠伤寒杆菌X4064(gyrA1816、Δ腺苷酸环化酶基因-1、Δ环腺苷酸受体基因-1) 为腺苷酸环化酶基因和环腺苷酸受体基因双重突变的减毒菌株，具有萘啶酮酸抗性，由第二军医大学分子遗传学教研室提供。重组pQEM1 质粒由德国海德堡大学分子生物学中心Bujard 教授提供，MSP1第1号基因片段表达的M1蛋白在MAD20型MSP1上的氨基酸位置为34-595。实验用鼠为BALB/c小鼠。
2．接种菌液的制备及其活菌数的测定：X4064(pQEM1)经培养扩增后，以倍比稀释法测定接种菌液中的活菌数，计算每毫升菌液中的活菌数，并测定菌液的吸光度［1-3］。
3．小鼠的灌胃接种及肝脾中活菌数的计数：1次灌胃0.2 ml菌液，使含活菌数在109［4］。取灌胃接种的小鼠每组5个，杀取肝脾，匀浆后定量涂布含氨苄和萘啶酮酸的LB平皿，37℃ 培养过夜，计数菌落数，取5个鼠的平均值绘制消长曲线。
4．灌胃接种小鼠组织中分离菌的鉴定：挑取计数平皿上的菌落转接SS琼脂平皿，鉴定菌种。挑取鉴定后的菌落进行扩增，用小规模碱变性法抽提菌中的质粒，用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后在1%琼脂糖凝胶上电泳［5］。
5．灌胃接种小鼠组织中分离菌表达能力的鉴定： 已鉴定的组织分离菌 X4064(pQEM1)经培养表达后,取全菌进行 Western blot反应，第1抗体为恶性疟疾病人血清，经减毒鼠伤寒杆菌菌体吸收后作1∶100稀释。第2抗体为HRP标记的羊抗人IgG，作1∶100稀释［6，7］。
结果
1．倍比稀释法测定活菌数的结果：倍比稀释法测定接种菌液，每毫升平均活菌数为4×109 个，其A600约为0.9。40 ml接种菌液离心沉淀，沉淀菌用32 ml、0.01 mol/L、 pH值7.2的磷酸盐缓冲盐水混匀，即0.2 ml中含活菌个数为1×109个。
2．小鼠组织细胞中分离菌的鉴定：培养后菌落无色透明，有的菌落中出现黑点。双酶切出1条碱基数为1.6 kb的特征性插入条带。因此，从接种小鼠组织中分离到的菌确为减毒鼠伤寒杆菌X4064(pQEM1)。
3．小鼠组织细胞中分离菌再表达能力的测定：在理论分子量处呈现阳性条带，从小鼠组织中分离到的X4064(pQEM1)依然具有表达M1蛋白的能力。
4．X4064(pQEM1)在小鼠组织中数量的消长：X4064(pQEM1)灌胃接种BALB/c小鼠，以同量X4064灌胃接种BALB/c小鼠作为对照，前者在LB平皿中加入氨苄和萘啶酮酸，后者仅加入萘啶酮酸。X4064(pQEM1)在接种小鼠后的第4天即在肝脾中被检出，第14天达高峰，以后逐渐下降。X4064(pQEM1)和X4064在小鼠肝脾中的消长曲线基本一致（图1），可见X4064(pQEM1)所携带的重组pQEM1质粒能稳定地存在于宿主菌中，并不妨碍其入侵宿主细胞。
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