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应用原位杂交技术检测人肝组织中输血传播病毒核酸 |
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2%甘氨酸、2×SSC EDTA、0.4%Triton X-100，各放置10分钟，3μg/ml蛋白酶K 37℃消化30分钟，浸入4%多聚甲醛10分钟，2×SSC平衡并热变性切片后加预杂交液(10%葡聚糖硫酸脂，50%去离子甲酰胺，500μg/ml变性鲑精DNA，1×Denhardt s，2×SSC，0.1%SDS)，置37℃ 2小时，滴加经热变性探针1μg/ml，42℃杂交20小时。经梯度SSC洗涤，滴加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(1∶800)，置37℃ 1小时，用PBS缓冲液洗涤后加硝基四氮唑烂(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(PCIP)，置室温暗室1小时，用PBS缓冲液洗涤终止显色，然后用甘油封片。阴性对照为杂交液，不加探针。
四、结果判定：以肝组织切片中出现特异性蓝紫色产物为标准，定位TTV基因。
结 果
阳性杂交信号呈蓝紫色团块状或颗粒状，集中于肝细胞核内，在整个肝组织中均匀分布。阴性对照中未见蓝紫色产物。17份标本中共有7份呈阳性，阳性分布情况为：正常人检测5例中，1例TTV阳性；5例乙型肝炎患者中，3例TTV阳性；4例丙型肝炎患者中，2例TTV阳性；3例戊型肝炎患者中，1例TTV阳性。
讨 论
TTV病毒是由Nishizawa等［2］应用代表性分析法(representational difference analysis,RDA)发现的。该病毒为单链DNA病毒，无包膜，病毒基因组全长3 739个核苷酸，有两个开放读码框ORF1和ORF2。目前，尚未确定TTV属于哪一科病毒，但它具有微小DNA病毒科的某些特征。Okamoto等［3］对日本各型肝病患者、暴露于血液或血制品的高危人群及供血员的血清检测，结果发现各型肝病患者的TTV DNA检出率均高于供血员；在肝脏组织中的TTV DNA 滴度较血清中高10～100倍。受血者感染TTV后，表现为一过性或持续性病毒血症，并与ALT异常有关。但由于样本较小，TTV与肝功能损害的关系尚待进一步研究。该病毒也可经粪口途径传播［4］。
本研究用于标记探针的TTV DNA片段位于病毒基因组的ORF1区，探针DNA经序列测定，与日本TTV核苷酸序列同源性为96.0%，并用BLAST程序检索了GenBank＋EMBL＋PBD序列库，除与日本报道的TTV DNA有很高的同源性外，未发现与其他病毒的基因序列有高度的同源性。原位杂交结果显示，TTV在肝细胞内复制，且集中在宿主的细胞核内，说明TTV可能为核内寄生或其基因已整合至细胞基因组中。感染TTV的宿主细胞未见明显的坏死倾向，提示该病毒可能比较温和。被TTV感染的细胞核浆比高于未感染的细胞，提示该病毒感染可能与细胞所处的繁殖周期的不同时期有关。由于TTV基因组较小，全长仅有3 000个核苷酸，因此，其复制可能要依赖于宿主细胞的某些功能。
本研究结果表明，各型肝炎病人的TTV感染率(6/12)高于正常人群(1/5)，这与TTV感染的血清流行病学调查结果一致［4］。在其他组织中是否存在TTV感染，是否有TTV健康携带者，以及TTV感染的临床意义等问题有待进一步的研究。
本文经庄辉教授修改，特此致谢
作者单位：李伯安、程云、李靖、高蓉、赵景民、王松山、张敏、罗清华 100039 北京，解放军第三○二医院免疫研究室；
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