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rrn操纵元序列PCR鉴定术后龟分支杆菌暴发感染的研究 |
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mycobacterium.
【Key words】 M. chelonae subsp.abscessus Polymerase chain reaction Gene level
1998年4月1日～5月31日，深圳市某医院发生了一起医院内术后暴发感染。我们从病原学角度确认此次医院内术后暴发感染的病原菌为龟分支杆菌脓肿亚种［1］，在此基础上，采用聚合酶链反应技术从分子水平上进一步确认此次术后暴发感染的病原菌为龟分支杆菌脓肿亚种。而且分支杆菌生长缓慢，传统的伯杰氏细菌分类鉴定方法耗时长，生化项目多，不利于临床早发现、早诊断。因此，在利用rrn操纵元序列PCR鉴定龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株的基础上，建立一套快速、特异、敏感的PCR扩增体系鉴定分支杆菌，用于临床的早期诊断。现将结果报道如下。
材料与方法
一、材料：
1.菌种来源：53株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株均从术后感染患者伤口分泌物或病灶组织中分离。菌株的分离和菌型鉴定均按照“结核病诊断细菌学检验规程”和《伯杰细菌鉴定手册》第9版进行。结核分支杆菌、龟分支杆菌龟亚种、龟分支杆菌脓肿亚种、偶然分支杆菌、母牛分支杆菌、耻垢分支杆菌和草分支杆菌标准株均由中国药品生物制品检定所提供。
2.引物序列：
(1)16s rDNA的引物序列：上游引物序列：5′-CACATGCAAGTCGAACGGAAAG
G-3′，下游引物序列：5′-GCCCGTATCG
CCCGCACGCTCACA-3′，根据Tevere［2］报道设计，由上海生工生物工程研究所合成。
(2)16s-23s rDNA引物序列：上游引物序列：5′-GAAGTCGTAACAAGG-3′，下游引物序列：5′-CAAGGCATCCACCAT-3′，根据Mark［3］报道设计，由上海生工生物工程研究所合成。
3.主要仪器和试剂：PCR扩增仪(PE-9600型)、TaqDNA聚合酶、4种dNTP、Tris碱、DNA Marker均购自上海生工生物工程研究所和北京华绿渊公司，溶菌酶、蛋白酶K均购自Promega公司。
二、方法：
1.PCR模板的制备：每管0.5ml TE缓冲液制备菌悬液，100℃水浴30分钟灭活细菌。每管加入50μl的溶菌酶混匀，37℃水浴2小时，然后加入80μl蛋白酶K(20mg/ml)，60μl 10%SDS，56℃水浴3小时，然后用酚、氯仿抽提，抽提完后沉淀，适量TE溶解。
2.PCR反应：
(1)16s rDNA PCR扩增：反应总体积为25μl，5μl模板DNA，2μl引物，2μl dNTP，1UTaqDNA聚合酶，2.5μl 10×buffer。反应混合物混匀并加液体石蜡。94℃变性5分钟后，进行35个循环，循环条件为：94℃ 45秒、55℃ 45秒、72℃ 90秒，循环数35次，最后1个循环后，72℃延伸10分钟。
(2)16s-23s rDNA PCR扩增：反应总体积为25μl，5μl模板DNA，2μl引物，2μl dNTP，1UTaqDNA聚合酶，2.5μl 10×buffer。反应混合物混匀后，加液体石蜡。进行30个循环，循环条件为：94℃ 45秒、45℃ 1分钟、72℃ 1分钟，最后1个循环后，72℃延伸10分钟。
3.PCR产物电泳检测：取8μl PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后紫外检测、拍照。
结 果
一、16s rDNA PCR扩增结果：53株临床分离株和结核分支杆菌均扩增出1条特异的584bp DNA带，证明引起此次医院内术后暴发感染的致病菌为分支杆菌。16s rDNA PCR扩增检测体系，可把分支杆菌和非分支杆菌区别开。
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