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重量法测定血苯 |
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计时华1 何美景2 马新强3 朱心强1 钟鸣文1 叶怀庄1 吕安生1
苯进入人体内形成有很高活性的环氧化物，可与多种蛋白形成加合物。有研究用同位素标记的苯(C62H6)-白蛋白为内标衍生后，用气-质联仪（GC-MS）测定血液中的苯-白蛋白加合物［1］。由于采用昂贵的仪器和同位素内标物，在一般实验室难以进行。本研究采用重量法测定，简单方便，结果比较令人满意。
一、对象与方法
1.对象：接触组为皮鞋厂接触苯的不吸烟工人76名(男16名、女60名)，对照组为在校大学四年级不吸烟学生60名（男女各30名），动物组为100～150 g Wistar大鼠60只。
2. 仪器与试剂：电子天平(AE101,美国)，离心机(LD5-2A,北京医用离心机厂)，恒温培养箱(PYX-DHS-50×65,上海跃进医疗仪器厂)，电加热锅(江苏电加热器厂)，热解吸器（江苏科学仪器厂），气相色谱仪（GC-14B，岛津），电泳仪（ECP3000型，北京新技术发展公司），CaCl2、乙醇、醋酸钠、丙酮、乙醚、盐酸、甲酸（均为分析纯）及生理盐水，C18小柱(河北绿杨滤材厂)，Tenax GC管。
3.血苯-白蛋白的测定：
（1）采样及苯-白蛋白的粗提:采集接触组（班后）和对照组人群静脉血5 ml,用EDTA抗凝后离心取得血浆，准确移取2.0～3.0 ml血浆,加0.5 mol/L CaCl2 2.0 ml后，室温放置过夜。第2天离心，取上清液加5 ml生理盐水和10 ml含有0.2 mol/L醋酸钠的95% 乙醇溶液，于30℃ 孵育30分钟，离心，取全部上清液,按1∶10的比例加入上述酸化乙醇，放置15分钟，离心，留取下层沉淀物，经丙酮、乙醚洗涤后离心，沉淀物在45℃下用N2吹干。
（2）称量：在上述粗提物中加6 mol/L HCl 6 ml,于110℃ 水解24小时。水解物用N2吹干后，加1％ 甲酸溶液1ml溶解。然后经C18小柱净化，用（1+9）的乙腈和1% 甲酸溶液10 ml，分2次洗脱。合并2次洗脱液，在N2下干燥至恒重，称量。即得苯-白蛋白加合物的量。
4.血苯-白蛋白的代谢趋势：
(1) 将60只大鼠经口按每公斤体重150 mg投苯（苯溶于花生油中灌胃），然后每天取3只股动脉采血，按上述方法处理血样并测定，观察血苯-白蛋白含量的变化。
(2) 取上述第15天的大鼠血样抗凝，同时制成血浆并加CaCl2，两份血样均4 ℃保存，每天测定，观察结果变化。
（3）测定5名不吸烟工人（接触苯工龄>3个月）的班前和班后血，观察血苯-白蛋白含量的变化。在生产情况稳定时，对其每隔半月采1次班后血，连续6次，观察结果变化。
5．车间空气苯的测定：按文献［2］进行。
二、结果
1.本法获得的苯-白蛋白加合物经SDS凝胶电泳鉴定纯度较高（>95%），加合物在凯式定氮仪上加6 ml浓HCl，约81℃ 水解24小时，蒸气经Tenax GC管后排放。 Tenax GC管在热解吸器上250℃解吸，-30℃冷凝浓缩，闪蒸20秒，用N2带入GC测定。与纯苯的保留时间完全一致，证明含有苯，为苯-白蛋白的加合物。
2.本法的检出限为2 mg/ml, 加标（自制C62H6-白蛋白）回收率为91.2% 。用GC-MS法同时测标准样品（自制C62H6-白蛋白）［1］，结果经F检验，精密度之间差异无显著性；经t检验，平均值之间差异无显著性，见附表。
附表 重量法与气-质联仪法的测定结果比较(mg/ml)
标样浓度 重量法(n=7) 气-质联仪法(n=3)
s s
2.0
2.0
0.1
1.9
0.1
25.0 24.2 0.3 24.0 0.1
50.0 48.7 0.2 48.5 0.1
3.大鼠经口投苯后，其血中苯-白蛋白加合物在第3天出现，然后逐天增高，直至第15天增幅趋于0。从第15天至少到第20天未出现下降趋势。第15天的血样抗凝后，4 ℃下可保存7天以上；如制成血浆并加CaCl2后，4℃下可放置30天以上，测定结果无变化。
4.5名接触苯工龄在3个月以上的不吸烟工人血苯-白蛋白班前(35.6～52.1 mg/ml)与班后(38.5～60.0 mg/ml)的结果，经秩和检验[1] [2] 下一页
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