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体外培养的施万细胞在平面和聚乙醇酸纤维网架上的迁移 |
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cell of SC was still trending to wrapping fibre up without neurons.
【Key words】 Schwann cell; Polyglyooli acid; Stereoframe; Cell migration
在神经系统发生过程中，施万细胞(Schwann cell,SCS)沿轴索迁移形成周围神经的有髓神经纤维髓鞘；在周围神经纤维损伤后，SCS能增生、迁移形成细胞索(Büngner带)，并以细胞桥形式把神经断端连接起来，轴突长入并形成髓鞘［1］。因此周围神经纤维的发生或再生均涉及SCS的迁移问题，但在体内要观察到SCS的迁移过程是困难的，体外培养条件下对研究SCS的迁移变化主要局限于平面水平上。为此，我们用具有较好生物相容性的人工合成的生物降解材料聚乙醇酸(PGA)纤维［2］为SCS培养构建三维环境；并用光、电镜及免疫细胞化学等方法观察SCS在立体网架上迁移变化的特征，同时与平面的培养进行比较，为研究周围神经发生和再生过程中SCS的迁移提供实验依据。
材料和方法
1. SCS培养
新生1～2d的SD大鼠18只(本院动物实验中心提供)，于无菌条件下取坐骨神经和臂丛神经。在体视显微镜下剥除神经外膜，用L15基础培养液(Gibco公司)洗涤，再把神经切成0.1mm3小块，贴附于24孔培养板的孔底圆型盖玻片上(预先涂布鼠尾胶原)。加入适量完全培养液(用含10%小牛血清的L15培养基，内加青霉素和链霉素各105IU/L)，37℃、5%CO\-2培养箱培养。每隔1d换培养液1次，培养3周。
2. PGA三维网架构建
直径10～15μm的人工生物降解材料PGA纤维(中国南通)用蒸馏水反复泡洗后高压消毒，用基础培养液浸泡片刻。在SCS培养24h后加入培养孔中，让纤维交叉散布在孔底，形成孔底的三维网架。部分培养孔底不加纤维，作三维立体培养环境的对照组。
3. 光镜观察与测量
每天在倒置显微镜下观察培养的细胞，用测微尺分别测量SCS在三维网架上和无网架的培养孔底上的迁移距离。
4. 培养细胞的免疫细胞化学染色
参照Gu等［3］方法，用酶联免疫细胞化学法。取培养14d的培养物用4%多聚甲醛(内含5%蔗糖)室温固定，0.2%Triton-100以及1%羊血清和小牛血清白蛋白等预处理。1∶400小鼠抗牛S-100蛋白抗体为一抗(Sigma公司)，室温中孵育4h；然后用1∶400 HRP标记的羊抗小鼠抗体为二抗(Gibco公司)，室温中孵育4h；DAB暗处显色，硫酸镍胺加强。最后脱水、透明和封片。
5. 扫描电镜观察
培养7d或14d的标本经基础培养液洗涤后2%戊二醛(4℃)固定，洗液洗涤，再用1%锇酸(4℃)后固定，乙醇逐级脱水。HCP-2临界点干燥仪(HITCHI公司)干燥，在JFC-1100离子溅射仪(JEOL公司)中喷金，JEM-T300扫描电镜(JEOL公司)观察。
结果和讨论
1. 倒置显微镜观察
对照组植块培养24h，35%的神经植块可见少数细胞开始移出，SCS迁移最远约0.06mm。48h，70%植块有细胞移出，细胞数较多，迁移最大距离为0.12mm。72h有90%的植块迁出细胞，原有的细胞生长良好，迁出细胞数增多，迁移距离达0.15mm，见细胞开始端对端或交错排列成细胞束，以植块为中心向四周放射状迁移。培养到1周时，植块外的细胞数继续增多，最远距离为0.46mm以上，细胞除成束排列外，还有成堆聚积现象，形成具有特征性的“细胞岛”。培养至2周时，植块间迁移出的细胞基本融合，细胞放射状排列的方式消失。平面上的SC形态主要表现为长梭形，少数成三角形。在实验组中，三维网架环境中培养48h的植块，可见少数细胞开始爬到距离最近的PGA纤维上，细胞长橄榄形或球形。72h，位于细胞迁出路径和PGA纤维的交叉处，可见许多细胞伸出细长的突起和PGA纤维相连，PGA纤维上的细胞增多，细胞在PGA纤维上每天约迁移0.08mm(图1)。6d时，PGA纤维上的细胞更多，细胞仍呈两种形态，每根纤维上均为一种形态的细胞；球形细胞成串珠状排列，长橄榄形细胞间多以突起首尾相接。在纤维交叉处，SCS可呈多极性迁移，但始终沿纤维方向迁移。到2周时，可见到长橄榄形细胞螺旋式包裹PGA纤维；至10d左右，PGA纤维上的细胞逐渐多于同孔底部平面的细胞。
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