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检测HBVDNA Ig |
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CIC不同，前者含有核酸，后者可能不含遗传物质［1］ 。病原体是传染病的始动因子，故研究不同Ig类型抗体结合病原体的情况具有重要意义， 但目前少见报道。本文将免疫捕捉法和PCR技术有机地结合起来，以HBV为研究对象，成功地建立了检测 HBVDNA/Ig-TCIC ( HBVDNA/IgM、IgG和IgA-TCIC)的免疫捕捉法PCR技术，并对其意义进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 研究对象 乙肝血清标本共108例，采自厦门市中医院，临床诊断按北京会议修订标准进行。另取健康献血员血清标本15例和丙型肝炎血清标本5例分别作阴性和疾病对照。
1.2 实验材料 抗人IgM、IgG和IgA(依次为μ、γ、α链特异性)的羊IgG：卫生部上海生物制品研究所产品。HBV基因引物：根据HBVadr亚型pADR-1株基因，Sangon公司合成，经鉴定为电泳纯，正股1861～1878 5 -TGTTCAAGCCTCCAAGCT-3 ；负股2268～2284 3 -AGTGCGAATCCACACTC-5 。PCR试剂盒(热变性法)：厦门泰伦生物公司产品。 限制性内切酶:Sau3A I promege产品。
1.3 HBVDNA/IgM、IgG和IgA-TCIC的检测
1.3.1 血清处理 参见文献［2］进行。简述如下：取血清用终浓度为3.5%的PEG沉淀2次，弃上清，沉淀用等血清体积的PBS溶解。
1.3.2 免疫捕捉 分别包被羊IgG抗人IgM、IgG和IgA (依次用于HBVDNA/IgM、IgG和IgA-TCIC的检测)7.5 μg/ml，每孔50 μl，4℃18 h，PBS-T洗涤3次；取上述沉淀溶解物40 μl加入反应孔，37℃1 h，同上洗涤6次；每管加入无菌双蒸水40 μl，于95℃变性20 min， 得变性液。
1.3.3 PCR扩增 10.buffer 5 μl、混合dNTP液(各10 mmol/L)1 μl、MgCl2 (25 mmol/L)4 μl、引物各15 pmol、1U Taq酶和变性液30 μl、补足水至50 μl反应体积。94℃变性1 min，55℃复性30 s，72℃延伸1 min，共循环35次，最后以72℃10 min结束循环。每批做阴阳性标本各3管。
1.4 热变性法检测全血清HBVDNA 参见文献［3］进行，扩增条件同上。
2 结果
2.1 特异性考察
2.1.1 阻断试验 随机取阳性血清5份，参照文献［4］进行。结果IgM和IgA组2例阳性和1例强阳性标本阻断后为阴性，另2例强阳性标本阻断后为弱阳性；IgG组阻断后只1例弱阳性，其余均为阴性。
2.1.2 中和试验 取上述阻断试验用标本，参照文献［4］进行。结果3组均为2例阳性和1例强阳性标本中和后为阴性，另2例强阳性标本中和后为弱阳性。
2.1.3 替代试验 对15例健康献血员和5例丙肝患者血清进行检测，结果所有健康献血员标本均为阴性，5例丙肝患者中有1例标本为HBVDNA/IgM和IgA-TCIC同时阳性。
2.1.4 重复性考察 每批试验均同时做3例阳性和3例阴性标本，共做15批。所有45份阴性标本均为阴性；在45份阳性标本中，“++”为38次(84.4%)，其余7次在上下波动。
2.1.5 酶切鉴定 随机取反应产物进行Sau3A I酶切，结果其片段与理论分析一致，见图1。
图1 PCR产物限制性酶切图谱
Fig.1 Restriction mapping and electrophorisis analysis of PCR production
Note:M.marker; 1.positive control; 2.Sau3A I cuts
表1 3类HBVDNA/Ig-TCIC 8种组合模式的检测结果
Tab. 1 Distribution of cases in eight models of HBVDNA/Ig-TCIC
HBVDNA/
IgM-TCIC HBVDNA/
IgG-TCIC HBVDNA/
IgA-TCIC Cases
+ + + 36
+ + - 9
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