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抗人M和N型GPA特异性单克隆抗体的制备和鉴定 |
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，第2周重复注射1次，第3周尾静脉注射2×106细胞/只，3 d后取脾细胞进行细胞融合。
1.3 杂交瘤细胞系的建立 2×107SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与108免疫小鼠脾细胞在PEG-1500（Serva公司）作用下进行融合。生长的杂交瘤培养上清用细胞凝集法筛选：在96孔平底聚苯乙烯软板复孔中加入杂交瘤培养上清，1滴/孔，随后加入PBS（pH7.4）洗涤和配制的20％OM和ON型红细胞悬液，5 μl/孔，室温振荡30 min，肉眼观察凝集反应结果。选择仅对OM或ON型红细胞发生凝集的培养上清孔的杂交瘤细胞进行克隆和亚克隆，经扩大培养后，注射Balb/c小鼠腹腔诱生腹水。
1.4 McAb效价测定 细胞凝集法测定杂交瘤培养上清和腹水的抗体效价。
1.5 McAb类型测定 使用Isostrip kit(Boehriger公司)，按试剂盒说明书操作。
1.6 McAb特异性测定
1.6.1 间接免疫荧光试验 在细胞凝集试验步骤之后，用PBS洗涤细胞2次，再加入稀释100倍的羊抗鼠IgG-FITC(Jackson公司)，50 μl/孔，室温反应45 min，同前洗涤细胞，荧光显微镜（Olympus）下观察红细胞膜荧光。
1.6.2 免疫印迹试验 分别以M型和N型红细胞制备膜蛋白［4］，进行SDS-PAGE（12％），一份凝胶用过碘酸-希夫试剂（PAS）染糖蛋白，另一份凝胶对硝酸纤维素膜电转移（50 V过夜），然后对膜进行免疫反应，底物DAB显色。
1.7 McAb结合抗原的表位测定 用经胰蛋白酶(Sigma)和神经氨酸酶(Sigma)作用后的红细胞与McAb进行细胞凝集和间接免疫荧光实验。酶作用条件：洗涤后的M型或N型压积红细胞50 μl，悬浮于0.5 ml 20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（含5 mmol/L CaCl2，pH8.0）,加入1 mg胰蛋白酶；或同样的红细胞悬浮于20 mmol/L醋酸盐缓冲液（pH5.0）,加入0.5 U神经氨酸酶，37℃温育4 h，PBS离心洗涤和悬浮细胞，用于细胞凝集和间接免疫荧光试验。
1.8 McAb对血型的检测 用自制McAb与长春博德生物技术公司的血型试剂平行随机检测血样本的MN血型系统。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立 细胞融合后，经过对阳性克隆的筛选和连续克隆化，建立了5株分泌特异性 McAb的杂交瘤细胞系，其中4株与M型红细胞、1株与N型红细胞发生特异性凝集反应。5株杂交瘤细胞均在小鼠体内诱生了腹水。我们对其中2株(3G4、5E11)凝集M型红细胞和1株(5C7)凝集N型红细胞的McAb进行了进一步的鉴定。
2.2 McAb的效价 细胞凝集法测得杂交瘤细胞培养上清和腹水的抗体效价（表1）。
表1 McAb的凝集效价
Tab.1 Hemagglutination titers by McAb
McAb RBC type Culture medium Ascites
3G4 M 1∶64 1∶10 000
5E11 M 1∶32 1∶5 000
5C7 N 1∶16 1∶2 000
2.3 McAb的类型 Isostrip kit测得3株McAb均属于IgG2a亚类、Kappa型轻链。
2.4 McAb的特异性
2.4.1 McAb与红细胞膜抗原结合的特异性 间接免疫荧光试验显示，3G4和5E11仅与M型、5C7仅与N型红细胞膜抗原呈现免疫荧光阳性反应。
2.4.2 McAb对GPA分子识别和结合的特异性 免疫印迹试验的结果显示，3G4和5E11能识别和结合M型红细胞膜蛋白中的GPA蛋白带，与N型红细胞膜蛋白没有交叉反应；而5C7能识别和结合N型红细胞膜蛋白中的GPA蛋白带，与M型红细胞膜蛋白没有交叉反应（图1）。
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