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CD8 细胞免疫亲合柱的研制及条件探讨 |
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化物酶由华美公司提供； Avidin-FITC由山东省农科院生物技术中心提供；流式细胞仪FACScan为Becton Dickinson公司产品； Olympus荧光显微镜。
1.2 外周血单个核细胞（PBMNC）的分离 用淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque）常规分离。
1.3 生物素化抗CD8单克隆抗体的制备 参考文献［2］进行,制备后于4℃保存。
1.4 生物素化抗CD8单克隆抗体用于FACS检测 取PBMNC各100 μl ，一份加入10 μl本文制备的生物素化抗CD8单克隆抗体，于4℃作用30 min后，用PBS洗2次，加入FACS配备的荧光二抗，进行流式细胞术分析;另一份采用标准抗CD8单克隆抗体和FACS配备的荧光二抗进行CD8+细胞检测，比较两种处理方法的结果，以鉴定本文制备的生物素化抗CD8单克隆抗体的效果。
1.5 生物素与抗CD8单克隆抗体交联效果鉴定 取PBMNC各100 μl,分别加入10 μl本文制备的生物素化抗CD8单克隆抗体，洗涤后一份加入GAMIgG-FITC，另一份加入Avidin-FITC，在荧光显微镜下观察CD8+细胞比例，以鉴定生物素与抗CD8单克隆抗体交联效果。
1.6 亲合素与Bio-Gel的交联反应 按文献［3］进行，交联后于4℃保存备用。
1.7 Avidin与Bio-Gel交联效果判定 将100 μl已交联的Avidin-Bio-Gel用PBS洗涤5次，然后加入生物素标记辣根过氧化物酶（l：25稀释），4℃作用1 h（此间轻轻震荡混匀1次），用PBS洗5次，用饱和联苯胺/H2O2显色，以相同处理的Bio-Gel作为阴性对照，显色方法见文献［4］。
1.8 用免疫亲合柱纯化细胞 将PBMNC调整细胞浓度为5×107～2×108 ml-1，加入约l/10体积的生物素化抗CD8单克隆抗体，4℃冰箱中作用30～120 min（在此过程中轻轻震荡1次）。用含1％BSA的PBS洗细胞2次，并将细胞悬于适量的5％BSA中。将Avidin-Bio-Gel装于10 ml层析柱内，用PBS充分冲洗后，用5％BSA平衡柱子加细胞于柱上，使细胞缓缓流入凝胶内，静置约3～5 min。先以5％BSA洗去未吸附的细胞，再以PBS洗去BSA，用吸管轻轻吹打凝胶，CD8+细胞即与凝胶脱离，随PBS流出柱子，收集CD8+细胞进行检测。
1.9 CD8+细胞纯度及回收率测定 分别将未经柱分离的PBMNC上柱，用5％BSA洗下的未吸附细胞以及柱分离得到的CD8+细胞，采用单克隆抗体直接免疫荧光法，用FACS检测细胞表面CD8抗原表达百分率，计算出CD8+细胞纯度和回收率。
1.10 细胞活力测定 采用常规台盼蓝染色法计算经过纯化的活细胞数。
2 结果
2.1 生物素化抗CD8单克隆抗体用于FACS检测结果 利用本文制备的生物素化抗CD8单克隆抗体作为一抗，加入FACS配备的荧光二抗进行流式细胞术分析，结果与采用标准抗CD8单克隆抗体作为一抗进行流式细胞术分析的结果基本相同，说明本文采用的抗CD8单抗的效果令人满意，同时也证实生物素化未影响该单抗的活性。
2.2 生物素与抗CD8单克隆抗体交联效果鉴定 在荧光显微镜下观察发现，用生物素化抗CD8单克隆抗体处理的细胞，在分别用荧光二抗或Avidin-FITC作用后，CD8+细胞含量基本相同，表明生物素与抗CD8单克隆抗体交联效果良好。
2.3 Avidin与Bio-Gel交联效果的鉴定 采用生物素化辣根过氧化物酶鉴定Avidin与Bio-Gel交联效果，结果显示未交联的Bio-Gel经生物素标记辣根过氧化物酶处理后，加入底物溶液联苯胺/H2O2后无颜色变化，而已交联了Avidin的Bio-Gel经同样处理后呈肉眼可见的棕褐色，应用显微镜也可以观察到凝胶颗粒表面有棕褐色微晶沉着（见图1）。说明交联介质表面已有Avidin结合上去。
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