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热休克蛋白70与家兔颈总动脉球囊损伤后增殖细胞核抗原表达的关系 |
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这一增生过程与多种即刻早期基因、癌基因的异常表达以及多种细胞因子、生长因子有关［1］。热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)与细胞增殖的关系已逐渐引起人们重视。细胞在应激状态下，其分化状态会发生改变，而HSP70在调控细胞的分化走向上具有重要作用。细胞学实验证实，HSP70的产生与细胞增殖存在一定关系，特别在DNA合成期更为明显，当细胞从分裂的G0期进入G1期，伴随着HSP70的产生［2］。而增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是DNA聚合酶S的辅因子，在细胞周期中对细胞分裂和DNA合成起关键作用［3］。本实验旨在通过PCNA来反映细胞增生，探讨HSP70在动脉损伤后内膜增厚中的作用，为防治再狭窄提供实验依据。
材料与方法
一、模型复制及实验分组：
选用普食喂养的健康大耳白兔24只，体重2.10～2.75 kg，雌雄不拘，4～6月龄。用戊巴比妥钠(30 mg/kg.iv)麻醉，采用Clowes法［4］行右颈总动脉内皮剥脱术。术后连续3 d肌注青霉素40 万U/d，预防感染。造型兔随机分为术后3、9、14、28 d组(n=6)，左颈总动脉相应部位为正常对照。
二、取材及处理：
各组分别于预定天数静脉麻醉下取右颈总动脉损伤段及左颈总相应部位血管段。每段血管均常规透射电镜制样及光镜制样，蜡块作厚4 μm的连续血管横切片，至少备4张玻片，分别作HE、弹力纤维染色及HSP70、PCNA免疫组化染色(玻片预先涂多聚赖氨酸防脱片)。
三、指标检测：
1.免疫组化染色：切片常规脱蜡入水，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶；经抗原修复后加二抗同种动物正常血清封闭，然后依次加入一抗(HSP70或PCNA单抗，均为Sigma.Co产品，反应1～2 h)、生物素化二抗及链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物；DAB显色；苏木素复染。PCNA染色胞核棕色者为表达阳性(增殖期)细胞；HSP70染色胞核或/和胞浆棕色者为表达阳性细胞。均设置替代对照染色(以磷酸盐缓冲液代替一抗)。
2.计算机图像分析(德国Contron.Co.IBAS仪)：于20×物镜下测定各阳性片着色的平均光密度(MOD)和阳性表达面积率(area%，为阳性表达的面积占视野中所有核总面积的百分率)。前者反映阳性表达强度，后者反映阳性表达率，参照罗莉等［5］方法(略作修改)计算表达指数(expression index, EI)：
EI(%)＝MOD×area%×100
四、统计分析：
数据均以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用Newman-Keuls法q检验，双侧α＝0.05；采用Pearson s乘积矩相关分析。
结果
一、形态学表现：
HE及弹力纤维染色均示明显的内膜剥脱后增生反应，14 d组最为明显；HE染色显示增厚的内膜中细胞丰富，细胞形态较长梭形平滑肌细胞胖大，呈纺锤形，似成纤维细胞样(图1)，透射电镜(日产H-600型)下于新生内膜层及靠近内弹力膜部位的中膜可见大量“合成型”平滑肌细胞，其胞浆内肌丝成分减少或消失，而粗面内质网、线粒体和游离核糖体等丰富。
Fig 1 Histologic section with HE stainning of an artery 14 days after injury.(Note the red elastic fibers and the smooth muscle cells with thin blue nuclei.There are lots of fibroblast-like cells in the neointimal within internal elastic laminae.×20)
图1 损伤后14 d HE染色组织片
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