|
脂质体介导的VEGF基因对培养血管细胞增殖的影响 |
| |
ul.VEGF might promote proliferation of VEC,but didn t cause proliferation of VSMC,which is favorable for preventing and treating ischemic disease and artery restenosis.
MeSH Endothelial growth factors;Liposomes;Transfection;Muscle,smooth
血管内皮生长因子（vascular endothelium growth factor,VEGF）是近年发现能高效、特异促血管内皮细胞（vascular endothelial cell,VEC）有丝分裂、继而促进血管形成的一种糖蛋白［1］。因而，VEGF或其基因有望在冠脉缺血和肢体缺血等疾病中发挥重要作用。本实验利用脂质体介导的基因转移法将含VEGFcDNA的真核表达载体pSVI21导入体外培养的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）中，并将转染后的条件培养液作用于培养的VEC，观察VEGF在VSMC及其条件培养液中的表达，比较其对VSMC和VEC 增殖的影响，探讨VEGF基因向血管细胞转移的可行性及其对细胞增殖的影响。
材料与方法
(一)质粒的提取与纯化：应用含人VEGF的真核表达载体pSVI21（美国Boston大学心血管研究所吴天根博士惠赠），经酶切鉴定后，用碱裂解法提取并纯化质粒［2］，保存备用。
(二)细胞培养、基因转移及分组： 取兔主动脉，消化并分离内皮细胞，加入含10%胎牛血清的M199培养液（Gbico BRL公司）于37℃ 5% CO2 培养箱中培养，通过形态特征和Ⅷ因子相关抗原进行鉴定。同时用贴块法行VSMC培养，通过形态特征和(α-actin抗原进行鉴定［3］。基因转移采用脂质体介导法［4］，每组于装有小盖玻片的培养皿中种入5×105VSMC，培养过夜，次日换无血清培养基，将质粒与脂质体（lipofectamineTM reagent,购自Life Technologies公司）混匀（含量见各组），室温下静置15 min后，加入培养皿并加入无血清培养基至10 mL，16 h后换液，继续培养48 h。将第2代对数生长期VSMC分6组分别为：VSMC1组pSVI21 15 μg+脂质体45 μg；VSMC2组pSVI21 30 μg+脂质体90 μg；VSMC3组pSVI21 60 μg+ 脂质体180 μg；VSMC4组加入不含VEGF cDNA的载体30 μg为空载体对照组；VSMC5组加入脂质体90μg为脂质体对照组；VSMC6仅加无血清培养基为空白对照组。
另外将第3代对数生长期的VEC分为4组，每组5×105接种于装有盖玻片的培养瓶培养过夜后，VEC1，VEC2及VEC3组分别换VEGF基因转染48 h后的VSMC1、VSMC2及VSMC3组的条件培养液各5 mL，加常规培养液至10 mL，VEC4组仅换等量常规培养液继续培养48 h，另外在剩有各种培养液5 mL的各组VSMC培养皿中也均加常规培养液至10 mL，继续培养48 h。
(三)Northern blot杂交：取各组VSMC制备成109/L的细胞悬液，加10 mL常规培养液，孵育24 h后，换无血清M199 24 h时收集细胞，按Gibco公司 BRLTRIZOLTM reagent使用说明，抽提细胞总RNA，每组总RNA用量10 μg。Northern blot杂交参照Sambrook方法［5］进行。［32P］dATP标记VEGF cDNA用随机引物法，操作步骤按试剂盒（Promega公司）说明进行，观察各组VSMC的VEGF mRNA的表达。
(四)Western印迹法分析：取各组VSMC条件培养液行蛋白质电转移与膜封闭，抗原抗体反应按《分子克隆实验指南》［6］方法进行。一抗为兔抗人VEGF（购自中山生物技术公司），二抗用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（购自中山生物技术公司），显色程度用MPIAS-500多媒体图象分析系统分析以积分光密度表示VEGF含量。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 冷刺激条件下硒和维生素E对大鼠心脏内血管活性物质的影响
下一个医学论文： 氧反常心肌细胞内游离钙浓度的变化及丹参素和SOD的影响
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文