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大鼠脑缺血 |
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lutamate transporter in membrane.
MeSH Cerebral ischemia;Reperfusion injury;Free radicals;Dexamethasone;Rats
谷氨酸是脑内主要的兴奋性神经递质之一，其在突触间隙积聚会引起神经元损伤。正常时谷氨酸不能在突触间隙中降解，而是被神经元突触前膜或神经胶质细胞的谷氨酸转运体所转运，从而终止其对突触后膜的兴奋性作用［1］。有关资料证实［2］：缺血性脑损伤中有氧自由基参与并与兴奋性氨基酸相互作用。也有资料认为地塞米松有抗自由基作用［3］。本文利用大鼠脑缺血-再灌注损伤模型探讨脑缺血-再灌注损伤时谷氨酸转运体功能及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量变化及地塞米松的对抗作用，并探讨脑缺血再-灌注损伤机制中谷氨酸转运体功能变化的作用及其与自由基的关系。
材料与方法
一、实验材料：
［3H］-L-谷氨酸(美国杜邦公司，152.07×1010 Bq/mmol)；SOD(河北保定市生化营养源开发中心，4 000 U/mg)；MDA、SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。高速冰冻离心机(日本Tomy公司出品，RS-20Ⅲ型)；液体闪烁计数仪(瑞典LKB公司出品，1209型)；分光光度计(上海分析仪器厂出品，751型)。
二、实验方法：
1.动物模型复制：健康Wistar大鼠24只(250～350 g)，雌雄兼用，随机分为3组，每组8只。Ischemia-reperfusion(I-R)组 ：20%的乌拉坦(0.5 mL/100 g)ip麻醉，行颈部手术，分离两侧颈总动脉，于甲状软骨上缘右侧分离肌肉至枕骨腹面，先在枕骨嵴旁钻1小孔，扩大为3 mm×2 mm大小的骨窗，暴露基底动脉，用特制无损伤的动脉夹夹闭上述3个动脉，脑电图变为一平线，观察120 min，然后将3个动脉夹全部放开，继续观察30 min。I-R+地塞米松组于夹闭血管前10 min静脉推注地塞米松(10 mg/kg)，手术过程同I-R组。假手术对照组实验过程基本同I-R组，但血管不夹闭。实验完毕后断头取脑，按自然分界分离皮层、海马、纹状体，液氮冷冻，-70℃冰箱保存。
2.谷氨酸转运体膜颗粒的制备：参照Gilia［4］方法分别制备皮层、海马、纹状体突触膜颗粒。脑组织以10倍冰冷的匀浆液匀浆后，再以6000 r/min离心10 min取上清液，依次加低张、悬浮、装载缓冲液分别在4℃、1500 r/min离心20 min，均取沉淀，最终加装载缓冲液备用。
3.谷氨酸转运体功能的测定：取突触颗粒20 μL加入膜外液(0.15 mol/L NaCl 180 μL， 0.25 μL ［3H］-L-谷氨酸)中，置30℃水浴中反应10 min，用2 mL冷0.15 mol/L NaCl终止反应，迅即再加24 mL冷NaCl液，以0.45 μm滤膜定时冲洗抽滤，滤膜烘干并置入液闪瓶中，加甲苯闪烁液，隔夜经液体闪烁仪测定。样本均做双管。膜颗粒的蛋白质含量测定采用Lowry s法。谷氨酸转运体功能表达为［3H］-L-谷氨酸摄入量(pmol*min-1*mg-1Pro)。
4.SOD活性、MDA含量的测定：准确称取脑组织，按试剂盒规定步骤加样、温育，在532 nm处比色测定。SOD采用1%的匀浆，活力单位为U/mg；MDA采用10%的匀浆，其含量单位为nmol/mg湿重；
5.统计学处理：实验结果以±s表示，两组间比较采用方差分析，q检验。
结果
一、大鼠脑缺血-再灌注损伤时谷氨酸转运体功能的变化：
I-R组的皮层、海马、纹状体突触颗粒谷氨酸转运体转运功能均明显低于假手术对照组(P＜0.05，P＜0.01)。I-R+地塞米松组谷氨酸转运体功能明显高于I-R组(P＞0.05，P＜0.05，P＜0.01)，与假手术对照组无明显差异(P均＞0.05)。见表1。
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