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试管牛和试管羊胚胎性别的鉴定 |
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和方法
1．1 材料
实验所用的奶牛和山羊为上海医学遗传研究所奉新动物试验场提供， 挑选身体健康并有生育能力的母牛和母羊作为受体。牛的卵巢取自屠宰场，羊卵巢取自奉新动物试验场的健康母羊。牛冷冻精液购自上海奶牛育种中心，羊新鲜精液采自奉新动物试验场的健康公羊。TM199和KSOM培养液购自GIBCO/BRL公司，PCR试剂购自PE公司和Promega公司，（α-32P）dCTP购自Amersham公司。实验所用的洗卵液为含肝素（1单位/ml）和小牛血清白蛋白（0．3％）的磷酸盐缓冲液； 卵母细胞成熟（IVM）液为含FSH （1μg/ml）、 LH （10μg/ml）、 E2（1μg/ml）和发情期牛或羊血清 （80μl/ml）的TM199培养液； 卵母细胞体外受精（IVF）液为含肝素（2单位/ml）的BSABO液； 胚胎发育培养液为KSOM培养液〔5〕。
1．2 卵母细胞的体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）和胚胎的体外培养（IVC）
按文献〔6〕的方法并作改进后进行。简而言之，在无菌条件下，取出卵母细胞，在体视显微镜下选择有多层卵丘细胞、形态良好的卵母细胞，经洗卵液洗涤后放入IVM液中进行成熟培养，在39℃、5％CO2、饱和湿度的条件下培育22～24小时后，再放入IVF液中，内有已经获能的精子（1×106/100μl）进行体外受精5～6小时，经洗涤后，受精卵置于胚胎发育培养液中继续培养5～6天，直至桑椹后期。所有胚胎在受精卵期间进行外源基因的显微注射。
1．3 胚胎细胞取样和性别鉴定
应用显微操作技术，从桑椹胚期的胚胎中吸取4～6只细胞，放入5～10μl胚胎级水中，热变性之后，离心吸出胚胎DNA释出液，按文献〔2,3〕方法进行巢式PCR扩增SRY基因序列。采用的PCR引物见表1。第一次PCR反应体积为10μl，其中含引物6pmol，Taq聚合酶1．5单位，10×PCR反应缓冲液1μl，DNA扩增在PE9600热循环仪中进行，反应条件是94℃变性1分钟，55℃退火30秒钟，70℃延伸1．5分钟，共20个循环。取第一次PCR扩增产物2μl作为第二次PCR的模板，同时做3管进行第二次PCR。反应体系中除含有SRY基因引物外，还加入10pmol牛或羊β珠蛋白基因的扩增引物作为内对照，PCR反应条件同上，共30个循环。取5μl第二次扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色后观察，牛SRY基因扩增片段的长度为127bp，羊SRY基因扩增片段长度为187bp,而内对照（β珠蛋白基因）扩增片段的长度为250bp。
表1 巢式PCR扩增奶牛和山羊SRY基因的引物序列
Table 1 PCR primers for amplification of bovine and goat SRY genes
动物 引物对 序列5 -3 扩增产物长度(bp)
牛 第一次PCR CCATGAACGCATTCATCGTGTG
ACGAGGTCGATACTTATAGCCC 208bp
第二次PCR TCAGCAAGCAGCTGGGATATG
ACGAGGACGATACTTATAGCCC 127bp
羊 第一次PCR CCATGAACGCATTCATCGTGTG
ACGAGGTCGATACTTATAGCCC 208bp
第二次PCR GTCTCGTGAACGAAGACGA
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