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用普通琼脂糖代替低熔点胶回收DNA片段 |
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erature for isolating DNA fragment．
Key words： polymerase chain reaction； agarose； DNA isolation； fusion phenolchlorofom
在DNA直接测序等多种实验中，需要鉴定通过聚合酶链式反应（PCR）扩增的产物质量，以及纯化、回收特异性产物。琼脂糖凝胶电泳是鉴定DNA质量常用的方法，对凝胶电泳分离的DNA片段进行回收有多种方法，常用的有DEAE－纤维素膜电泳法、透析袋电洗脱法〔1〕、低熔点琼脂糖胶中回收等〔2〕。这些方法所用材料昂贵，亦较复杂。为了寻求一种简便实用的回收方法，作者采用国产普通琼脂糖凝胶电泳分离PCR双、单链产物，紫外光下切下产物条带，加热使凝胶熔化，再用苯酚－氯仿抽提回收，回收的DNA质量可靠。
1 材料和方法
1．1 材 料
2400型PCR仪、310型DNA测序仪由美国PE公司产；紫外仪由上海天能科技有限公司产；电泳仪由北京六一仪器厂产；台式高速离心机由湖南仪表厂产。QIAquick Spin纯化柱由德国进口。测序试剂盒、序列胶、模板抑制剂、分析缓冲液等由美国PE公司产；TaqDNA聚合酶、扩增缓冲液由加拿大Sangon公司产；电泳级普通琼脂糖由中科院上海药物研究所产；引物由上海生物工程公司合成；其他试剂采用国产分析纯试剂配制而成。
1．2 方 法
引物序列为：引物1∶5′TGTTGTCTCCTAGGTTGGCTCTGACTG3′，引物2∶5′GTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTGC3′。引物1位于外显子7上游，引物2位于外显子8下游。抽肘静脉血、抗凝、溶血，收集白细胞核，蛋白酶K消化，用苯酚－氯仿抽提法提取基因组DNA。扩增方法与作者以往采用的方法相同〔3〕。扩增产物采用普通琼脂糖凝胶电泳，紫外光鉴定扩增效果，在紫外光下切下产物条带，置入离心管中，加入5倍体积的TE缓冲液，加热至95℃ 2分钟使凝胶溶化，然后再用苯酚－氯仿抽提法收集DNA片段。单链产物的回收系先以双链产物为模板用不对称PCR方法制备单链DNA片段，再用前法进行电泳回收。对回收所得的DNA片段进行紫外比色测定DNA量，然后对已定量的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳、切下DNA带等依前法再回收，再次紫外比色测定回收量，（双链产物回收后先经50℃复性，再测OD值），计算回收率。QIAquick Spin柱对照回收则按试剂盒要求进行。对两种方法回收所得的单、双链DNA进行测序，鉴定回收的DNA质量。
2 结 果
用热熔化－苯酚－氯仿抽提法回收的双、单链产物再用琼脂糖凝胶电泳检测显示条带清楚，特异性好，反应物中的引物和非特异性产物均已去除干净。用这种方法回收得到双链、单链产物作为模板直接测序结果均佳，图谱清晰，本底极低，见图1、图2。所测定的P53基因外显子7、8及其间的内含子7序列片段长共585个bp，与国外测定的标准序列比较，在内含子7上第73个bp处有一个C/T多态位点，第93个bp处有一个T/G多态位点，尚未见报道，其余碱基均与国外报道相同。用单链产物和双链产物作为模板测定序列完全相同。但双链测序更简便。序列为：
用QIAquick Spin纯化柱回收的单链产物作为模板测序图谱亦较好、但纯化柱回收的双链作为模板测序则本底过高、测序基本失败。取已定量的纯单、双链的DNA片段，用这两种方法进行回收，单、双链产物回收各重复30次实验，经紫外比色测量显示：热熔化－苯酚－氯仿抽提法回收的回收率明显高于纯化柱法（P<0．01），结果详见表1。
表1 两种方法回收DNA片段回收量（OD值）的比较
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