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一步法提取植物DNA用于大规模RAPD分析 |
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张明永 孙彩云 梁承邺
中图分类号： Q523 文献标识码： A 文章编号： 0253－9772(2000)02－0106－01
One Step Isolation of Plant DNA for Largescale RAPD Analysis
ZHANG Ming-yong SUN Cai-yun LIANG Cheng-ye
（South China Institute of Botany, The Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650,China）
RAPD技术已广泛地用于植物的系统演化、种群多样性、群体遗传学及杂种种子纯度的鉴定等工作中〔1～3〕。本文基于快速节省的原则对碱液法提取植物DNA进行一些改进。
1 材料与方法
DNA提取方法 取10～20mg幼叶，加100μl 0.5mol/L NaOH(或附加0.5％～1.5％巯基乙醇)研磨后，取40μl研磨液加入200μl 100 mmol/L TrisHCl pH7.6缓冲液(或附加0.5％不溶性聚乙烯吡咯烷酮，PVP)中，8 000×g离心5min，上清液即可用于PCR反应。
PCR反应体系含10mmol/L TrisHCl pH8.8,50mmol/L KCl,1.5mol/L MgCl2,0.1％ Triton X100,200μmol/L dNTP,1.0 U Taq酶(华美生物工程公司),10pmol/L 10bp的附机引物(上海生物工程公司)。PCR扩增在94℃变性4 min后进入循环,94℃变性1 min,35℃复性2 min,72℃延伸2 min,40个循环后72℃延伸10 min。
2 结果与分析
用这种方法提取的水稻、玉米、小麦、菜心、花生、香蕉和蕃薯幼叶的DNA，直接用于PCR反应，都可扩增出RAPD谱带（图1），并有较好的重复性。表明这种方法用于以上植物的DNA提取，做RAPD分析是可行的。这比传统的CTAB等方法减少了很多步骤，可大大节省时间。水稻、玉米、小麦和菜心直接用0.5mol/L NaOH提取放入100mmol/L TrisHCl中后在4℃放置1月后仍可用于PCR反应。但香蕉、蕃薯则发生褐变，因而在用0.5mol/L NaOH提取这两种植物的DNA时，NaOH提取液中附加0.5％的巯基乙醇并在起缓冲作用的Tris－HCl中附加0.5％的不溶性PVP，以与引起谒变的多酚类物质起作用，不溶性PVP可在离心中除去，这样提取的香蕉与蕃薯DNA放置后不再发生褐变，且在4℃放置1月后也可用于PCR反应。
图1 0.5mol/L NaOH提取水稻、玉米、小麦、菜心、花生、香蕉和蕃薯幼叶DNA的RAPD结果
应用本方法的过程中需要注意以下几个问题：(1)材料应越幼嫩越好，因本法不含CTAB或SDS这样的细胞膜裂解剂而是靠研磨方法破碎细胞。(2)NaOH溶液应每周新配。(3)如含酚类物质较多的材料就应附加巯基乙醇或PVP。(4)此法中失败的通常原因是在提取DNA时所用材料太多〔4〕，因而为控制取材时的均一性可用打孔器取样。
基金项目：广东省自然科学基金资助
作者简介：张明永(1968－)，男，汉族，助理研究员，博士，专业方向：遗传学。E-mnil:[email protected]
张明永（中国科学院华南植物研究所，广州510650）
孙彩云（中国科学院华南植物研究所，广州510650）
梁承邺（中国科学院华南植物研究所，广州510650）
参考文献：
〔1〕 Yu KF,et al.Random amplified polymorphic DNA(RAPD) analysis. In:Glick BR,et al(eds),Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology〔M〕.New York:CRC Press,1996,287～301.
〔2〕 Rogers SO,et al.Extraction of total cellular DNA from plants,algae and fungi.In:Gelvin [1] [2] 下一页
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