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小鼠精原细胞的分离和纯化 |
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高，产量却很低；另一些报道产量高但纯度低。1977年，Bellve等［2］报道从生后8d小鼠睾丸中获得了纯度91%的A型精原细胞，产量达2×107个。但使用的小鼠却多达60余只，耗费了大量的实验动物。我们的前期工作已表明，小鼠生后7～8d，其生精上皮内基本只有支持细胞和A型精原细胞，其他各级生精细胞尚未发育形成［3］。在体外，支持细胞总是先生殖细胞而贴壁。因此，本实验选用生后7～8d小鼠的睾丸，事先排除其他生精细胞的污染，用组合酶消化获得细胞悬液，经Percoll不连续密度梯度离心，再用选择性贴壁法纯化，获得了较高纯度的精原细胞，基本满足了体外培养的需要。
材料和方法
1.实验动物
昆明小白鼠由本校实验动物中心提供，按常规方法饲养管理。参照文献［3］取7～8d小鼠用于细胞分离。
2.主要试剂
胶原酶IV(Sigma)，透明质酸酶(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，D-MEM(Gibco)，新生牛血清(NBS，Gibco)，Percoll(Pharmacia),胎牛血清(FBS，Gibco)。
3.细胞的分离
3.1 分离液的配制：按PBS∶Percoll=1∶9的比例把湿热灭菌后的Percoll原液配制成90%的Percoll溶液。用无钙、镁离子PBS，按表1所列方案配制Percoll各梯度溶液。
表1 Percoll密度梯度的浓度、组成及密度
Table 1 Concentration, components and
density of Percoll gradients
Percoll
浓度
(%)
concentra-
tion of
Percoll(%) 各梯度液
体积(ml)
volume of
Percoll
gradients
(ml) 90%
percoll
(ml) PBS
(ml) 1%双抗
(ml)
1% penicillin
and strepto-
mycin(ml) 各梯度密度
(1 000g/L)
density of
Percoll
gradients
(1 000g/L)
11 9 1.1 7.8 0.1 1.0214
19 9 1.9 7.0 0.1 1.0312
27 9 2.7 6.2 0.1 1.0410
35 9 3.5 5.4 0.1 1.0508
43 9 4.3 4.6 0.1 1.0606
3.2 细胞悬液的制备：取7～8d雄性小鼠5～6只，颈椎脱臼法处死。无菌收集两侧睾丸，置于盛有PBS的小皿中。整个睾丸收集过程在0.5h内完成。用尖镊子仔细去除每个睾丸的脂肪垫、附睾及睾丸白膜，加入适量PBS(1～2ml)，吸管用力吹打，将曲细精管吹散。加入相当于组织体积10倍的含1g/L胶原酶的PBS后入温箱，在37℃、5%CO2条件下作用15min(期间晃动数次)。之后移入5ml的离心管，轻缓吹打1～2次，静置待曲细精管段沉降后轻轻吸除上清，再重复上述过程1次。加入含1.5g/L透明质酸酶和0.25%胰蛋白酶的PBS后入温箱，同样条件下作用5～10min，倒置显微镜下见曲细精管段软散，有的已消散成单细胞或小的细胞团即可。加入含10%NBS、1%青、链霉素的新鲜D-MEM培养液终止消化，移入离心管中，1 000r/min离心3min或静置5min，待软散的曲细精管及已解离的精原细胞沉降后，轻轻吸去上清。重新加入1.5ml新鲜培养基(D-MEM+7.5%NBS+7.5%FBS+1%谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1%青、链霉素+1%丙酮酸钠)，吹打8～10次，制成单细胞悬液。
3.3 Percoll梯度的制备及离心：从已制备好的每级Percoll梯度液中各取1ml，按密度从大到小依次叠加到10ml离心管中。将待分离的细胞悬液置于梯度最上层，以1 400r/min离心20min［4］。
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