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稳定表达的人GDNF基因对PC12细胞的分化作用研究 |
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duced to differentiate to neuronal cell with culture supernatant of BHK-GDNF cells. Conclusions The human GDNF can be expressed by constructed BHK-GDNF engineered cells, and human GDNF is able to induce the differentiation of PC12 cells to neuronal cells.
【Key words】 Glial cell line-derived neurotrophic factor; Genetic engineered cells; Cells differentiation
神经营养因子是一类能够促进神经细胞存活、生长和分化的蛋白质或多肽，在神经系统的发育、生长、损伤和修复等过程中发挥重要作用。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)是1993年Lin等［1］首先在鼠胶质细胞系B49中发现的一种具有特异地促进中脑多巴胺能神经元生存的神经营养因子。人和鼠GDNF分子有93%～95%的同源性。由于GDNF含有的7个保守的半胱氨酸残基与转化生长因子-β(TGF-β)的半胱氨酸残基位置一致，因此GDNF属于TGF-β超家族成员之一。人GDNF基因定位于染色体5p12-p13.1［2］，其成熟蛋白含有134个氨基酸残基。体内、外实验表明：GDNF具有很强的促进中脑多巴胺能神经元、中枢胆碱能神经元、脊髓运动神经元交感、副交感感觉神经元的存活作用［3～7］。目前，国外应用GDNF治疗帕金森病已经进入了临床Ⅲ期阶段［8］。在本研究中，我们从人胎儿脑组织中提取总RNA利用RT-PCR的方法克隆了人GDNF的基因，构建了真核表达载体；并且用构建pTARGET／hGDNF(±)真核表达载体分别转染BHK-21细胞，筛选出稳定表达人GDNF的BHK-hGDNF基因工程细胞；探讨GDNF对大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12的分化作用。
图1 pTARGET／hGDNF(±)表达载体的构建
Fig.1 Construction of pTARGET／hGDNF(±) expression vector
材料和方法
1.人GDNF基因的克隆、真核表达载体的构建与鉴定
脑组织来源于因故终止妊娠的胎儿(5个月)(宣武医院妇产科)。取100mg胎脑组织采用异硫氰酸胍一步法提取脑组织总RNA［9］。RNA进行琼脂糖甲醛变性电泳，如果28s和18s清晰无降解则进行反转录反应。在反转录反应中以OligdT15-18(Promega)为引物合成cDNA第1链。然后用cDNA为模板，以GDNF上游、下游引物(合成于上海生物工程公司)进行PCR反应(上游引物：5’gctcgag atg aag tta tgg gat gtc gt 3 ,下游引物：5’cggatcct cag ata cat cca cac ctt 3 )。 PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃ 45s,58℃ 1min，72℃ 1.5min，35个循环，72℃延伸5min。PCR产物在1.8%琼脂糖凝胶电泳中分析结果。用玻璃奶(博大公司)回收DNA片段约为560bp，克隆入pTARGET(Promega)真核表达载体中，经IPTG诱导蓝白菌落筛选后获得正向和反向pTARGET／hGDNF(±)两种克隆(图1)。用酶切和测序方法对克隆的基因进行鉴定。
2.用pTARGET／hGDNF(±)转染BHK-21细胞
将BHK-21细胞株(由中国预防科学院病毒所吴小兵博士惠赠)在RPMI1640(Gibco／BRL),10%马血清和5%胎牛血清，37℃、5%的CO2的条件下传代培养，以2×105细胞密度接种于35mm培养皿中。将pTARGET／hGDNF(+)和pTARGET／hGDNF(-)各2μg与10μl lipofecamine(Gibco／BRL)分别用无血清RPMI1640培养液稀释至100μl，混匀后室温放置30min，将形成的DNA-liposome复合物加入0.8ml的无血清RPMI1640培养液，然后加入60%汇上一页 [1] [2] [3] 下一页
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