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大鼠消化道促性腺激素释放激素受体mRNA的原位杂交研究 |
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NA，为进一步的功能性研究提供形态学依据。
材料和方法
1. 试剂
地高辛标记的GnRH受体cDNA寡核苷酸探针由大连宝生物工程有限公司合成。敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅱ(碱性磷酸酶)为武汉博士德生物工程公司产品。
2.组织材料
雄性SD大鼠5只，体重230～250g，断颈处死打开腹腔，分别取出胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠，置Bouin液中室温固定过液，按石蜡包埋程序将上述组织包埋于同一蜡块内，在严格限制RNA酶污染的条件下切成6μm厚的切片，贴于涂有3-Amino propyltriethoxy silane(APES)的载玻片上。
3.探针的制备
参照大鼠垂体GnRH受体cDNA序列设计而成［5］，序列如下：5′-ATGTATGCCCCAGCCTTC
ATGATGGTGGTGATTAGCCTGGATC-3′，经大连宝生物公司合成并在5′端作地高辛标记。
4.原位杂交组织化学程序
切片脱蜡水化后，经0.3%H2O2甲醇室温处理30min，蒸馏水洗涤3次。0.5mol/L TBS(pH7.3)1∶200稀释的蛋白酶K37℃消化15min，4%多聚甲醛5min，蒸馏水洗5min×3次，切片空气干燥后，每张切片滴加含2.0mg/L标记探针的原位杂交液20μl，湿盒中42℃杂交18h，2×SSC洗涤5min×2次(37℃)，0.1×SSC洗涤10min 1次(37℃)，滴加封闭液室温20min，不洗，滴加小鼠抗地高辛抗体37℃2h，0.5mol/L TBS洗2min×3次滴加生物素化羊抗小鼠IgG37℃1h，0.5mol/L TBS洗2min×3次，滴加SABC-AP37℃30min，0.5mol/L TBS洗5 min×4次，最后用BCIP/NBT显色液显色，室温30～50min，水洗终止反应，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。阴性对照作如下设置：(1)将切片用RNA酶进行预处理后杂交；(2)以不含探针的杂交液进行杂交；(3)用正常小鼠血清取代小鼠抗地高辛抗体进行杂交。
结 果
GnRH受体mRNA杂交信号阳性反应性细胞呈蓝色，背景不着色，反差明显，阳性细胞易于识别。3种阴性对照试验均呈阴性反应。
胃小凹的上皮细胞(图1)、大鼠胃底腺的壁细胞(图2)可检测到GnRH受体mRNA杂交反应信号，信号物质分布于胞质，核呈阴性。3段小肠绒毛上皮细胞均检到较强GnRH受体mRNA杂交信号，小肠腺细胞也有GnRH受体mRNA杂交信号，信号物质分布在胞质，胞核为阴性反应(图3)。盲肠、结肠和直肠的粘膜上皮及大肠腺上皮细胞也都检到较强GnRH受体mRNA杂交信号，信号物质也分布在胞质内，胞核为阴性反应(图4)。
讨 论
我们先前的研究已证明大鼠消化道从胃到直肠的一些粘膜上皮、腺上皮及肌间神经丛的副交感神经节细胞呈GnRH受体免疫反应性［2］，本实验观察到在胃肠上皮细胞及腺细胞均可检测到GnRH受体mRNA，说明消化道的这些细胞能合成GnRH受体。GnRH受体由327个氨基酸构成，有7个跨膜结构域，属G蛋白偶联受体，哺乳类垂体促性腺细胞上的GnRH受体和GnRH的结合有高度特异性，光亲和标记、层析电泳证明GnRH受体为分子量60 000道尔顿的糖蛋白，有3个N-糖基化位点，在90、98和291位的酸性氨基酸残基可能和GnRH的Arg相互作用，而发挥GnRH的生理调节功能［6，7］。GnRH在下丘脑-垂体轴外产生并在下丘脑-垂体轴外发挥生物学效应已有一些报道。GnRH受体mRNA在生殖器官如卵巢、睾丸、子宫肌层以及胎盘等处均有表达，提示GnRH在生殖调控中除刺激垂体分泌LH和FSH外，尚可直接和生殖器官发生作用，调节这些器官和细胞的功能［8～12］。在肿瘤细胞如乳腺癌、垂体促性腺细胞瘤、肝癌、肺癌等处也发现GnRH受体mRNA的表达，GnRH的类似物对肝癌等多种肿瘤细胞的增殖有抑制作用，提示GnRH参与肿瘤发生过程的调节［13～15］。GnRH对消化系统是否有功能意义，未见报道。我们先前的研究已经证实大鼠消化系统能自身合成GnRH［3，4］。本实验又进一步证实了消化道能合成GnRH受体。由此我们认为GnRH也是一种胃肠激素，它可由消化系统产生并作用于消化道粘膜上皮、腺上皮细胞，参与胃肠功能的调节。胃小凹上皮的主要功能是分泌粘液。胃上一页 [1] [2] [3] 下一页
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