|
肝纤维化启动期大鼠血清对肝星形细胞TGF |
| |
肝纤维化的基本病理改变主要是细胞外基质(ECM)，尤其是胶原蛋白在肝内的过度增生和沉积。最近研究表明，在肝脏中ECM的构成异常将直接影响肝细胞的形态和肝细胞功能。探讨肝脏ECM过度增生的生物学机制是肝脏病研究中的新热点［1］。本实验室多年从事中药“益气活血”方剂抗器官纤维化的实验研究［2］，证实益气活血方剂对纤维化有明显预防和治疗作用。尽管Gressner［3］提出了纤维化发生过程中单核细胞和纤维形成细胞旁分泌和自分泌细胞因子在器官纤维化中起重要作用，但尚不能从整体、器官、细胞和分子的不同层次提供对纤维化完整的认识。本研究制备正常大鼠血清，免疫性肝纤维化大鼠模型的不同造模时期病理血清和益气活血复方药物血清，培养肝星形细胞(hepatic stellate cells ，HSC)，观察其TGF-β1的表达，并研究了纤维化模型血清在肝纤维化形成中的作用，进而探讨了益气活血方剂治疗器官纤维化的部分机制。
材料和方法
1. 动物模型的制备
建立免疫肝纤维化模型参照于世瀛的方法［2］；新鲜猪血经0.4%枸橼酸钠抗凝，离心1 500r/min×10min制备血清，过滤除菌，分装后置-40℃保存备用。Wistar雄性大鼠40只，体重140～160g，购自于中国医学科学院动物所。动物分为正常组、造模组和药物血清组；造模组动物分成3、5、7周3组。以上各组动物均为8只。造模组大鼠腹腔注射猪血清，0.5ml/只、每周2次。用苦味酸-天狼猩红染色方法观察模型动物肝Ⅰ型和Ⅲ型胶原的变化。
2. 药物制备
益气活血方剂；丹参、赤芍、灸黄芪、柴胡等组成，购于北京同仁堂药店。中药水煎剂含生药3.5kg/L。
3. 鼠血清的制备
3.1 正常大鼠和造模大鼠血清：大鼠乙醚麻醉，无菌条件下腹主动脉取血10ml，4℃静置2h，离心1 500r/min×10min制备血清，经56℃60min灭活，－40℃冻存备用。
3.2 药物血清：正常大鼠禁食12h，连续两次灌服益气活血方剂，8ml/kg，两次给药间隔1h。2次给药后2h取血［4］，血清制备和保存方法同上。
4. HSC的分离和培养
HSC分离参照陈爽［5］方法并改良。用雄性健康大鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉0.4g/kg。腹部消毒后切开。剥离门静脉后迅速插管，及时剪断下腔静脉。37℃前灌流液200ml，10ml/min，冲洗肝脏血液。灌注链霉蛋白酶(Pronase-E为Merck产品)1.25g/L，37℃，8～12ml/min；胶原酶(Ⅳ Collagenas系Sigma产品)0.15g/L循环灌注20min。将液化的肝脏放入含胶原酶、链霉蛋白酶和DNA酶(DNase系Sigma产品)三角烧瓶中震荡消化20min，200目双层尼龙网过滤，离心2 250r/min×7min。D-Hank液洗涤2次。离心1 000r/min×2min，取其悬浮细胞。用终浓度18%的Nycodenz(Sigma)作为密度梯度离心介质，上被覆一层D-Hank液，离心4 600r/min×20min，收集界面处细胞。DMEM洗1次，培养液为内含20%胎牛血清(Hyclon)的DMEM(Gibico)，调细胞密度到106／ml。采用维生素A自发荧光和免疫组织化学方法进行HSC的鉴定。Desmin 为Dako产品，效价1∶400。
HSC培养在内置0.5×0.5mm盖玻片的12孔培养板中，pH为7.2，HSC密度106／ml，每孔0.5ml。37℃，5%CO2鹅卵箱培养48h，HSC均匀、牢固生长在盖片上。吸出培养液，用无血清DMEM洗涤，每孔加1%胎牛血清DMEM 0.5ml，在此基础上将培养细胞分为正常鼠血清组、模型血清组、药物血清治疗组。(1)正常鼠血清组：加10%正常鼠血清DMEM 0.5ml；(2)模型血清组：分别加入含3、5和7周造模大鼠血清10%DMEM 0.5ml；(3)药物血清治疗组：加造模3、5和7周病理血清组基础上，加入含10%药物大鼠血清DMEM 0.5ml。HSC 继续培养48h，用0.025的戊二醛，4℃，固定5min。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 小鼠下颌下腺条件培养上清对造血祖细胞增殖的影响
下一个医学论文： 人胚胎结肠肠神经系统发育的观察
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文