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小鼠卵巢 型胶原 间质金属蛋白酶和层粘连蛋白的合成 分布 |
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mouse ovaries, the amount of basement membrane ECM components did not change much, and maintain about the same level. In 12-month-old mouse ovary, the contents of the basement membrane ECM components decreased. Conclusion We suggest that the type Ⅳ collagen and LN of ovary may play important roles in the process of follicle development.
【Key words】 Type Ⅳ collagen; LN; MMP-2; Ovary
细胞外间质包括多种具有生物活性的大分子，它们在许多生理和病理过程中发挥重要作用。卵巢中有丰富的ECM，其中基膜就是由Ⅳ型胶原，层粘连蛋白，巢蛋白／制动素和硫酸乙酰肝素等多种ECM成分构成的［1］，但这些成分在卵泡发育中所起的作用目前尚不清楚。本实验选取小鼠作为实验动物，采用免疫细胞化学，组织化学和分子生物学等技术方法，研究不同年龄阶段的小鼠卵巢中Ⅳ型胶原，LN以及MMP-2的分布和变化规律，探讨这些ECM成分和蛋白水解酶对卵泡的发育过程所起的作用。为卵泡发育提供理论基础，为女性计划生育研究提供科学依据。
材料和方法
1.实验动物
由中国医学科学院动物所提供健康5d和15d，1、2、3、6和12个月雌性昆明小鼠，断颈处死后取卵巢。一侧用中性福尔马林固定液固定24h后，常规石蜡包埋、切片，片厚6μm。另一侧用OCT包埋，液氮迅速冷冻，组织块用恒冷箱切片机切片，片厚8～10μm。
2.试剂
兔抗小鼠Ⅳ型胶原抗体和兔抗小鼠LN抗体，由北京医科大学细胞生物室提供。生物素化山羊抗兔IgG和荧光素抗生物素蛋白DCS购于北京中山生物技术有限公司。地高辛DNA标记和检测试剂盒购于德国Boehringer Mannheim。含人Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA插入片段的重组质粒和含人MMP-2 cDNA插入片段的重组质粒，均由芬兰Tuomo Karttunen教授和Helena Autio-Harmainen教授惠赠。
3.荧光素-抗生物素蛋白间接免疫荧光染色
冰冻切片室温干燥后，在组织上滴加用PBS稀释的正常山羊血清，4℃孵育20min。分别加兔抗小鼠Ⅳ型胶原抗体和兔抗小鼠LN抗体，4℃孵育过夜。对照片此步以山羊血清代替第一抗体。冷PBS冲洗。加入生物素化的山羊抗兔IgG,4℃孵育1h。冷PBS冲洗。加入以碳酸氢钠缓冲液稀释的荧光素-抗生物素蛋白DCS，4℃孵育1h。冷PBS冲洗。用含PBS和对苯基二胺(P-phenylenediamine,PPd)的甘油做介质封片。标本在Olympus反射式荧光显微镜下观察、摄片。
4.石蜡组织切片原位杂交及统计学处理
含人Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA和人MMP-2 cDNA片段的重组质粒分别用磷酸钙法转化大肠杆菌DH5α菌株，碱裂解法进行质粒DNA的大量制备，PEG法纯化，限制性内切酶消化，低熔点琼脂糖回收cDNA片段，测定OD260和OD280值，计算DNA浓度。人与小鼠的Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链以及MMP-2均有很高同源性［2，3］。Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA和MMP-2 cDNA探针根据Boringer Mannheim公司推荐的标准程序进行cDNA探针非放射性标记及免疫检测。
石蜡组织切片以0.04% DEPC水裱贴于圆玻片上，52℃过夜烤干。新鲜二甲苯37℃，30min，室温10min，梯度酒精脱水，PBS冲洗。新配的0.3% Triton X-100 10min,PBS冲洗。蛋白酶 K(1mg/L)37℃ 30min，冷PBS冲洗。0.25%乙酸酐室温10min，PBS冲洗。余下步骤按常规原位杂交方法［4］操作，终止显色后梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，镜检并摄片。对照：以杂交液中免去探针作阴性对照。
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