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，广泛参与体内多种生命过程。NO由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)以L-精氨酸为底物合成。在中枢神经系统，神经细胞结构型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)分布广泛，其催化产物NO可能作为一种逆向信息传递物质参与海马的长时程突触传递增强(LTP)以及小脑的长时程突触传递抑制(LTD)过程，参与神经递质释放的调节、动物的学习和记忆以及痛觉的调制等。在病理状态下，NO涉及到脑缺血、癫痫、神经变性型疾病等多种病理过程［1，2］。由于NO性质活泼、半衰期短，研究中常采用NOS抑制剂间接观察NO的在体作用。本实验采用nNOS特异性抑制剂7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI)，间接观察NO对大鼠额区、顶区、后肢区、梨状区、压部后区和味觉区等脑皮质区内离子型谷氨酸(NMDA、AMPA、KA受体)和GABA受体的影响。
材料和方法
成年雄性Wistar大鼠14只，体重200～250g，对照组7只，腹腔注射生理盐水；用药组7只，腹腔注射7-硝基吲唑(30mg/kg)。动物存活6h后，断头取脑，液氮冷冻。取端脑经恒冷箱切片机连续横切片，片厚15μm，贴于明胶载片上，置入真空瓶内，－25℃冰箱干燥过夜。取各脑的相邻切片，分别用于Nissl染色和受体标记。
1. 受体标记
1.1 NMDA受体结合：切片入50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，25℃预反应15 min，移入含放射性配基［3H］MK-801(浓度5 nmol/L)孵育液，继续孵育60 min。Tris-HCl(4℃)缓冲液冲洗4次，每次2s，切片用2×3ml丙酮/戊二醛(100/2.5ml)迅速固定，冷风吹干。受体的特异性结合由［3H］MK-801的总结合量减去30μmol/L甘氨酸和50μmol/L精胺存在下的非特异性结合量后计算得出。
1.2 AMPA受体结合：切片入50 mmol/L Tris-acetat缓冲液(pH7.2)，4℃预反应3×10min，移入含放射性配基［3H］AMPA(浓度10 nmol/L)孵育液，继续孵育45min。如上所述进行冲洗、固定和吹干。非特异性结合加入10μmol/L使君子酸。
1.3 KA受体结合：切片入50 mmol/L Tris-citrate缓冲液(pH7.1)，4℃预反应3×10min，移入含放射性配基［3H］海人酸(浓度8 nmol/L)孵育液，继续孵育45min(4℃)。如上所述进行冲洗、固定和吹干。非特异性结合加入100μmol/L海人酸。
1.4 GABAA受体结合：切片入50 mmol/L Tris-citrate缓冲液(pH7.0)，4℃预反应3×10min，移入含放射性配基［3H］蝇蕈醇(浓度3 nmol/L)孵育液，继续孵育40min(4℃)。如上所述进行冲洗、固定和吹干。非特异性结合加入10μmol/L GABA。
2. 曝光
将切片贴于承托板上，覆盖氚片(hyperfilm,Amersham)，在4℃冷室中与氚标准(microscales,Amersham)同时曝光，时间为4周(AMPAR、KAR)、5周(NMDAR、GABAAR)。曝光完毕，用D-19b显影液和F-5定影液分别显影5min和定影10min，自来水冲洗30min后，自然干燥。
3. 受体定量分析
采用IBAS 2000图像分析仪(Kontron, Germany)测量不同脑皮质区标记灰度值，详细方法见Zilles等［3］的研究。脑皮质分区，按大鼠脑图谱由相邻Nissl染色切片在显微镜下重叠标出。相对于每个受体，每只动物至少检测6张切片。特异结合等于总结合量减去非特异结合量，所测灰度值借同期曝光校定的氚标准转变为fmol/mg蛋白放射性结合量。
结果和讨论
与对照组相比，腹腔注射7-硝基吲唑6h后，实验组大鼠脑皮质内标记的4种受体量均有不同程度的增加，而各受体的区域分布类型无变化(图1～5)。选择额区(Fr)、顶区(Par)、后肢区(HL)、梨状区(Pir)、压部后区(RS)和味觉区(Gu)等脑皮质区进行受体定量分析显示：NMDA受体在Fr、HL、Par2、和Ptr脑皮质区，AMPA受体在Fr、HL和Pir脑皮质区，KA受体在Fr、HL、Par2、Gu和Pir脑皮质区，GABAA受体在Fr、HL、Par1、Par2和Pir脑皮质区上一页 [1] [2] [3] 下一页
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