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人红细胞老化过程中花生凝集素和Con A受体电镜细胞化学研究 |
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洗，离心，反复3次，生理盐水等体积稀释后备用；(2)生理盐水将27%聚蔗糖(Ficol 400)分别配成23%，22%，21%，20%，19%5个浓度组，每组各取1ml按先高后低的浓度顺序，依次缓慢加入离心管，建立浓度梯度；(3)各例红细胞样本缓慢加入上述离心管，2 000r/min离心1h，收取每个样本上段聚蔗糖内的早期红细胞和下段聚蔗糖内的老化红细胞，生理盐水换洗，稀释备用。
2. PNAg和Con Ag的制备按Horrisberger方法［2］
(1)枸椽酸还原法配制7 nm胶体金；(2)胶体金分别与PNA(北京中山生物技术公司产品)和Con A(上海华美生物技术公司)稀释液按一定比例搅拌结合；(3)超速离心，4℃，36 000r/min 45min；(4)收集PNAg和Con Ag结合物，用0.2mol/L TB缓冲液(pH7.4)保存备用。
3. 红细胞膜PNAg和Con Ag细胞化学反应
红细胞经2.5%戊二醛固定4h后，用生理盐水换洗3次，转入0.2 mol/L Tris缓冲液pH7.4，换洗2次，调整细胞浓度至4×107/ml。取早期的和老化的红细胞各1ml分别与0.2mlPNAg液或Con Ag液混合孵育，37℃2h。对照组用D-半乳糖和α-甲基甘露糖作抑制对照实验。细胞化学反应后，细胞经2.5%戊二醛后固定30min，0.5%醋酸铀染色30min。常规电镜包埋，超薄切片，电镜观察，摄片。
4. 电镜图像处理及统计
每例标本在超薄切片上连续选取相邻网格右上角红细胞8个，在20 000倍电镜下摄片。用图像分析仪(HPLAS-1000，同济医科大学千屏影像公司产)对所选图片红细胞膜边缘长度进行画线(半自动)测量，并对相应膜上PNAg和Con Ag反应颗粒进行自动识别计数，计算出红细胞膜单位(μm)长度上PNAg和Con Ag颗粒数，所测结果用t检验进行统计学处理。
结果和讨论
早期红细胞膜表面平滑(图1)，老化红细胞表面可见不规则突起，膜边缘较模糊(图2)。早期红细胞和老化红细胞PNAg和Con Ag电镜细胞化学显示结果如图3～6。电镜照片经图橡分析和统计处理，各组红细胞膜上PNAg和Con Ag密度比较见附表。对照组PNAg和Con Ag呈阴性显示。
附表 早期红细胞与老化红细胞金标刀豆凝集素
A(Con Ag)和花生凝集素(PNAg)标记颗粒密度均值
Table Mean value of ConAg and PNAg particles on
young aged and old aged erythrocytes
早期红细胞
young aged
erythrocyte 老化红细胞
old aged
erythrocyte P值
P value
Con Ag
PNAg 13.4±2.8
16.1±3.5 25.9±3.6
57.5±12.9 ＜0.01
＜0.01
单位＝平均每μm红细胞膜长度上Con Ag和PNAg颗粒数
Unit=the mean number of Con Ag and PNAg particles on
1μm length of erythrocyte membrane
实验结果显示，老化红细胞膜上PNAg和Con Ag颗粒数均明显高于早期红细胞，揭示老化红细胞膜上半乳糖基和甘露糖基反应增加。文献报道，红细胞膜上复合多糖末端三糖常见的构成顺序从内向外依次为乙酰半乳糖胺-半乳糖-唾液酸或乙酰半乳糖胺-甘露糖-唾液酸［3］。细胞膜上复合多糖末端糖基唾液酸，常从表面覆盖着其下方的半乳糖或苷露糖。早期红细胞表面唾液酸较多，膜上其他糖基被其掩蔽不能充分暴露。但随着红细胞老化，膜上唾液酸含量可能受神经氨酸酶的作用明显下降，被其掩蔽的糖基相对暴露增加。因此，本实验老化红细胞膜上Con Ag和PNAg颗粒增加的结果可能与膜上复合多糖末端分子上较多唾液酸脱落以后暴露出相对较多PNA受体和Con A受体(即半乳糖基或甘露糖基)有关。
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