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O与生殖功能关系的研究受到了人们的重视，越来越多的证据表明，NO对生殖过程的许多环节有调节作用［1］。免疫组织化学结果证实，在大鼠及人的睾丸、附睾和输精管上有iNOS广泛分布，人及小鼠精子表面也检测到了nNOS的存在，提示NOS/NO对精子的生成及成熟有影响。Herrero［2］等的结果进一步证实，NOS/NO参与了小鼠精子的顶体反应，并且影响到其受精过程。对雌性生殖活动的研究表明，NOS/NO影响大鼠卵巢的排卵、早期胚胎的发育及胚胎的植入过程，而且NO的过度释放还是引起早期胚胎死亡的原因之一。免疫组织化学及RT-PCR的研究结果显示，妊娠小鼠和大鼠子宫中有eNOS、iNOS mRNA的存在及其蛋白的表达，但iNOS与妊娠的关系似乎更密切。
SA-30是从牛精子膜上分离到的一种可以和伴刀豆素A结合的糖蛋白［3］，主要分布在精子的顶体区，而且在获能及顶体反应后不消失，并已经证明用它免疫小鼠可导致生育力下降。本实验应用免疫组织化学的方法，对SA-30免疫后的小鼠子宫内iNOS进行了检测，旨在探讨SA-30对子宫iNOS的影响，从而进一步了解其抗生育机制。
材料和方法
1.SA-30的提取
按文献［3］的方法进行。
2.免疫动物试验
成年昆明系小鼠(8～10周龄)购自中国科学院遗传研究所，常规饲养1周后挑选健康者进行实验。SA-30(30μg/只)用等体积的完全弗氏佐剂充分乳化，背部皮内多点注射(0.1ml/只)，3周后进行第1次加强免疫，剂量改为40μg/只，佐剂用不完全弗氏佐剂，免疫途径为腹腔注射(0.1ml/只)，以后每隔两周加强免疫1次，剂量与途径均与第1次加强免疫相同，共加强免疫4次。对照组小鼠用不加SA-30的佐剂免疫。
3.取材
小鼠最后1次加强免疫后第8d，按雌雄3∶1的比例合笼，第2d清晨检查有阴栓者定为妊娠0d，妊娠第3d时颈椎脱臼处死(共5只)，迅速取出子宫于未加冰醋酸的Bouin液中固定48h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，Paraplast包埋，制备5μm厚切片。没有合笼的小鼠做阴道涂片确定发情周期，取间情期小鼠的子宫(共5只)，同上制备5μm厚切片。对照组小鼠和SA-30免疫组同时取材。
4.免疫组织化学染色
切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精后入蒸馏水进行水化，再用PBS(0.01mol/l,pH7.4，下同)洗5min；0.3%H2O2(无水甲醇配制)室温封闭15min，PBS洗3×5min；10%正常羊血清封闭，37℃20min；兔抗小鼠iNOS多克隆抗体(中山公司，1：20稀释)于4℃孵育18h，PBS洗3×5min；生物素化的羊抗兔IgG(SIGMA,1：50稀释)于37℃孵育30min，PBS洗3×5min;Streptavidin-HRP(GIBCO Ltd.,1:100)于37℃孵育30min，PBS洗3×5min;DAB(SIGMA)显色，常规封片。
阴性对照用PBS代替第一抗体。
结果和讨论
本实验以免疫组织化学的方法，对SA-30诱导小鼠子宫内iNOS表达的变化进行了检测，结果表明，经SA-30免疫后的小鼠，在妊娠第3d时子宫内的iNOS表达比对照组小鼠(只用佐剂免疫)明显减少，只在肌层偶见少数几个阳性细胞(图2)，而对照组小鼠的子宫内膜上皮及子宫腺上皮中则有大量的iNOS分布(图1)。间情期时，SA-30免疫小鼠和对照小鼠子宫内iNOS的分布及阳性细胞数量无明显区别，均在内膜基质中有大量阳性细胞(图3，4)。这一结果提示，SA-30免疫后，主要是对妊娠期子宫内的iNOS表达产生影响，而对间情期则无明显作用。说明SA-30对小鼠子宫iNOS的影响具有时期依赖性。
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