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鼠抗人B7 |
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ions.
Key words CD80(B7-1) Costimulatory molecule Monoclon al antibody Malignant lymphoma
B7是激发有效的细胞免疫反应所必需的协同刺激分子。B7家族包括3个成员 ，即B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和B7-3。其中对B7-1的研究最多，该分子为约50 kD的跨 膜 糖蛋白，基因定位于3q21，属免疫球蛋白超家族(IGSF)的成员之一。B7与CD28/CTLA-4的结 合对免疫应答起着重要的调节作用［1，2］。一般认为CD28作为协同刺激分子的受体 ，通过与APC上B7分子的结合，起着传递信号、增强或放大免疫反应的作用，而CTLA-4在调 控T细胞反应的起始和终止方面起重要作用。正常生理状态 下，B7家族的 成员在功能上既分 工又合作，协调地控制着免疫应 答的进行。而在一些病理状态下，这种协调性可发生改变［3］。最近的研究表明，B7家族协同刺激分子及其受体的异常表达在某些疾病尤其 是自身免疫性及过敏性疾病的发生、发展中起一定作用［4］。本文报道一株鼠抗人B 7-1功能性单克隆抗体的制备及其生物学特性，尤其是对恶性淋巴瘤细胞Raji和Daudi的生 长抑制作用及对B7分子介导的协同刺激信号阻断作用的初步研究结果。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 1640和DMEM培养基(Gibco美国)，HAT、HT选择培养基(Si g ma美国)，PEG(Boehringe德国)，G418(Gibco美国)，标准抗人B7-1单克隆抗体(Immunotech 法国)，Protein G(Pharmacia瑞典)，小鼠IgG亚类快速定性试纸(Argen法国)。
1.2 细胞株及培养方法 XG7-B7和XG1-B7为人多发性骨髓瘤细胞转人B7 -1基因细胞株(本室建立)，XG1为人多发性骨髓瘤细胞(本室建立)，L-B7为小鼠成纤维细 胞转人B7-1基因细胞株(本室建立)，Raji和Daudi为人恶性淋巴瘤细胞株(ATCC美国)。这 些细胞株均 采用含10%FCS的1640培养基培养，其中转基因细胞的培养基中添加抗性筛选药物G418，以保 持目的基因产物的稳定表达。
1.3 分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤建株 将生长良好的XG7-B7细胞注 入小鼠的背部皮下及腹腔(1×107/只)。间隔3 w重复免疫，第2次免疫后10 d左右眼框取 血测定血清效价。于加强免疫后3～4 d取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合(5∶1)，以5 0% 的PEG溶液(分子量1 500)为融合剂进行杂交，用含1%HAT、20%FCS的DMEM培养。以L-B7为检 测细胞株，用间接免疫荧光法对杂交瘤细胞的培养上清进行筛选，阳性孔细胞用有限稀释法 进行单克隆化培养，直至抗体分泌阳性率为100%。选择生长良好的杂交瘤细胞克隆(4E5)扩 大培养并及时液氮冻存。
1.4 4E5的生产及纯化 腹水型单抗的生产按本室建立的方法进行［ 5］，单抗的纯化采用Protein G亲和层析法：将腹水加入CaCl2、Sulfate dextran溶液 ，搅拌后静置0.5 h，离心(12 000 r/min，20 min)去除纤维蛋白。上Protein G亲和层析 柱， 甘氨酸洗脱，收集蛋白峰流出液，及时用pH 8.0的Tris溶液矫正pH至7.0，对PBS透析后 用 751紫外分光光度计测定抗体蛋白的含量，其浓度的计算公式为：抗体蛋白(mg/ml)=OD 280×1.55-OD260×0.76。
1.5 4E5的亚类鉴定 将快速定性试纸条轻轻插入含有约0.2 ml杂交瘤细 胞培养上清的小塑料管中，几分钟后试纸上出现与某一亚类名称相对应的蛋白条带， 此即该抗体所属的小鼠IgG亚类。
1.6 4E5的效价鉴定 以XG7-B7为检测细胞，将杂交瘤细胞的培养上清、 腹水和纯化后的抗体蛋白梯度稀释后与之结合。用间接免疫荧光法分析，以出现同样阳性率 及荧光强度时的最大稀释倍数为抗体的效价。
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