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人外周血NK细胞纯化方法的初步比较 |
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g/ml CD 3单抗(本室纯化） 、50 μg/ml CD8单抗（本室纯化）、豚鼠血清补体（-70℃冻存）、羊抗鼠IgG 0.1 mg/ml 、 新鲜绵羊红细胞（SRBC）、rIL-2 10万U/ml (本室自产）、PHA 1 mg/ml (广州医工院）。
1.3 人外周血PBMC的分离 取不同健康人外周血白细胞，用淋巴细胞分离 液分离出单个核细胞，经无菌生理盐水洗涤2次后即成。
1.4 NK细胞的纯化
1.4.1 单抗铺皿（Panning）法分离纯化NK细胞 无菌平皿用羊抗鼠IgG 0.1 mg/ml 1 ml 包 被8 h，用含5％NCS的生理盐水洗3次。单个核细胞悬液离心计数，2×107 细胞中加入CD3单抗及CD8单抗各200 μl，放置4℃ 30 min，用含5％NCS的生理盐水洗3次后 以5％NC S的生理盐水悬浮细胞，调整细胞浓度为5×106 ml-1。将上述细胞悬液加入已包 被好的平皿中 4℃ 40 min，轻悬使细胞重新分布再放置4℃ 40 min。收集非粘附细胞计数并用流式细胞仪 （FACS）检测NK细胞表面标记CD56、CD16分子。
1.4.2 补体裂解法（CDC）纯化NK细胞 单个核细胞悬液离心计数，2×1 07细胞中加入CD 3单抗及CD8单抗各200 μl，放置4℃ 30 min，取出用含5％NCS的生理盐水洗3次，离心，加 入 冻存的豚鼠血清1 ml 37℃ 放置1 h，用淋巴细胞分离液分离去除其中的死细胞，用5％NCS 的生理盐水洗2遍，细胞计数并以FACS检测NK细胞表面标记CD56、CD16分子。
1.4.3 绵羊红细胞花环法（SRBC）分离纯化NK细胞 分离单个核细胞， 以完全1640调整细 胞浓度为4×106ml-1 ，以完全1640调整新鲜绵羊红细胞浓度为3×108ml- 1，取两者各5 ml并 加入5 ml NCS混匀，500 r/min离心5 min，29℃ 孵育1 h，轻轻摇起细胞沉淀，用淋巴细 胞 分离液分离，吸取淋巴细胞分离液与上层液面间的细胞，以生理盐水洗2遍，计数所获细胞 并用FACS检测NK细胞表面标记CD16、CD56分子。
1.4.4 联合应用Panning法和补体裂解法纯化NK细胞
1.5 台盼蓝计数活细胞 配制0.4%的台盼蓝溶液，调节其pH值至7.0～7 .2，按9:1混合细胞悬液和染液，4 min内计数，死细胞着色而活细胞不着色。
1.6 MTT检测NK细胞的杀伤活性
1.6.1 肿瘤靶细胞 为本室长期保存的NK敏感性肿瘤细胞K562，以完全 培养基培养。
1.6.2 效应细胞 设2个对照组。①纯化NK细胞与外周血单个核细胞,②1 000 U/ml rIL- 2活化4 d的NK细胞和LAK细胞。
1.6.3 上述细胞杀伤活性的MTT法检测 在96孔板上将效应细胞分别按不 同效/靶25:1、12.5 :1、6.25:1、3:1与靶细胞K562孵育48 h后加入MTT 10 μl/孔，4 h后离心弃上清，加5 0％无水乙醇和50％二甲基亚枫混合液200 μl/孔，充分吹打、混匀。读取A570 nm和A630 n m值，按下列公式计算杀伤率：
杀伤率%=〔1-(杀伤孔(A570-A630)-效应孔(A570-A 630)〕×100%。
靶细胞孔(A570-A630)
1.7 RT-PCR检测IL-2 1 000 U/ml 作用下NK细胞IFN-γ mRNA表达情况 采用GIT一步法 提取 细胞总RNA，M-MLV逆转录酶为GIBCO产品，逆转录反应及PCR反应利用本室已建立的反应体 系［1］。分别检测未活化及活化NK细胞IFN-γ mRNA表达情况。
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