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CD34免疫亲合柱在脐血造血干 祖细胞分离与扩增中的应用 |
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4+ cells have obvious expansion efficiency and ability of CFU-GEMM forming.
Key words CD34＋ cells Immunoaffinity column Cell expansion
脐血中造血干/祖细胞具有较强的增殖分化潜能及维持体外长期造血能力 ［1］，但在脐血中比例仅为1%左右，临床输注时需输入体积较大，给治疗带来不便， 或出现因冻存液中的DMSO引起的副作用［2］。同时脐血体外扩增时其中大量T细胞的 存在可能影响体外的高速扩增［3］。本研究采用CD34免疫亲合柱对脐血进行CD34阳 性选择，使CD34+细胞充分富集，并进行体外长期培养扩增，以进一步探讨分离前后CD34＋细胞的增殖分化特性，为进一步扩大规模应用于临床奠定基础。
1 材料与方法
1.1 样本采集及MNC制备 无菌采集健康足月产新鲜胎儿脐血，淋巴细胞 分离液2 000 r/min离心20 min，取界面层MNC，生理盐水(NS)洗2次，计数备用。
1.2 主要试剂 IMDM培养基(Gibco)，CD34单克隆抗体(本室自制，纯度 ＞90%，终浓度10 μg/ml)，造血生长因子：rhIL-1(Genzyme)、rhIL-3(Sandos)、rhIL- 6(本室自制，比活 ＞ 2×108 U/mg)、rhG-CSF(Kirin)、rhGM-CSF(Sandos)、rhSCF(Sandos)和rhEPO(东阿阿 胶集团)。
1.3 CD34免疫亲合柱 本室自制，方法见文献 ［4］。
1.4 CD34＋细胞纯化 MNC调浓度1×108 ml-1，加入1/10体积 的生物素化CD34单抗，4℃ 、30 min，PBS液(含体积分数1%的BSA)洗2次，悬于含体积分数5%BSA的PBS液中。Avidin- Bioge l装于10 ml塑料柱内，PBS液平衡亲合柱后，取细胞上柱并静置3～5 min，PBS洗去未吸附细 胞 ，轻轻挤压塑料柱，CD34＋细胞即与凝胶脱离随PBS流入收集管内，离心洗涤后备用。
1.5 细胞表面标志分析 取CD34免疫亲合柱纯化后的细胞和MNC对照进 行FACS (FACScan,B D公司)检测。抗CD3、CD4、CD8、CD13、CD14、CD19和CD34抗体(Pharmingen)为FITC标记，C D34/CD38抗体(Pharmingen)为FITC/PE双标记，并设FITC标记的小鼠IgG(BD)做对照。
1.6 造血细胞体外扩增 IMDM中含体积分数10%的小牛血清和造血生长因 子(终浓度分别为rh IL-1 5 ng/ml、rhIL-3 2 ng/ml、rhIL-6 300 U/ml、rhG-CSF 10 ng/ml、rhGM-CSF 2 00 U/ml和r hSCF 50 ng/ml)。纯化后CD34＋细胞终浓度为5×104 ml-1,MNC终 浓度 为5×105 ml-1，37℃，体积分数为5%CO2孵育，分别于4、8、12、16、20 d传代 并计有核细胞数。
1.7 CFU-GEMM培养 IMDM培养基中含体积分数为20%小牛血清、10%马血 清和1.35%的甲基 纤维素，造血生长因子终浓度分别为rhIL-3 2 ng/ml、rhG-CSF 10 ng/ml、rhGM-CSF 2 00 U/ml、rhSCF 50 ng/ml和rhEPO 2 U/ml，细胞终浓度5×104 ml-1，混匀后接种于 12孔板，1 ml/孔，3复孔/组，37℃，体积分数为5%的CO2孵箱孵育10 d，光镜下计数＞50 个细胞的集落。
1.8 统计学方法 两组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 CD34+细胞纯化效果 5次独立实验的结果显示分离后CD34+细胞 纯度达49.62%±17.69%，明显高于脐血MNC(1.17%±0.68%)，同时细胞回收率为54.38% ± 11.91%。证实采用CD34免疫亲合柱纯化方法可大量富集脐血MNC中的CD34+细胞。同时造 血干/祖细胞以外的其他细胞均有不同程度的降低，1次实验分离前后各类细胞所占比例见表 1。
2.2 纯化后脐血造血细胞的体外扩增 分离后CD34+细胞和脐血MNC经rh IL-1+rhIL-3+rhIL-6+rhG-CSF+rhGM-CSF+rhSCF刺激有核细胞总数增殖倍数见图上一页 [1] [2] [3] 下一页
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