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pS2融合蛋白的原核表达及其性质鉴定 |
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60氨基酸残基的分泌型胞外多肽［3］。 pS2在胃 肠道粘膜修复中起作用，但临床研究发现， pS2(+)患者其无病生存期(RFS)和总生存期(OS) 较pS2(-)患者明显高，持续 pS2表达的乳腺癌患者预后好［4］，可作为乳腺癌抗雌 激素治疗反应的预测指标。本文构建PMS-pS2重组质粒转化大肠杆菌POP2136高效表达MS2- pS2融合蛋白，对pS2性质研究及制备抗pS2单克隆抗体以检测组织中pS2蛋白表达水平奠定了 重要基础。
1 材料与方法
1.1 RT-PCR 按已知pS2序列合成pS2上下游引 物［5］，上游引物 为5’CGGCGAATTCCAGACAGAGACG-
TGTACA 3’下游引物为5’CGGCGGATCCTTAAAATTCACACT CCTC CTC 3’(赛百盛公司合成)。从乳腺癌组织中提取RNA并逆转录成cDNA，以此为模板，加入内 对照β-actin、pS2上下游引物进行PCR ，扩增条件为94℃变性4 min，94℃30 s，55℃35 s，72℃40 s，30个循环，72℃延伸1 0 min。
1.2 PMS-pS2重组质粒的构建 RT-PCR产物中提纯的pS2片段，PM S-31b-ER重组质粒(本室构建)均经BamHI/EcoRI(GIBCO产品)37℃双酶切过夜，酶切产物纯 化后，二者以4∶1浓度加入T4DNA连接酶(GIBCO产品)23℃孵育3 h。
1.3 PMS-pS2重组质粒转化及融合蛋白表达
1.3.1 PMS-pS2重组质粒转化 转化方法见文献［6］。
1.3.2 MS2-pS2融合蛋白表达及纯化 将转化后的POP2136铺到含Amp+ 的 LB平板上，30℃过夜，挑几个单克隆于2 ml LB/Amp+中30℃振摇过夜，以1∶40倍稀释后 ， 继续振摇2.5 h，将温度迅速升到42℃诱导4～5 h。将诱导菌与非诱导菌，进行15%SDS -PAGE分析。融合蛋白的纯化按文献［6］。
1.4 MS2-pS2融合蛋白的性质鉴定
1.4.1 ELISA试验 用pS2 C端31氨基酸合成肽(北大生命科学中心合成) 包被ELISA酶标板，先将不同浓度的MS2-pS2融合蛋白与此合成肽抗血清(本室自制)于37 ℃孵育1 h或4℃过夜，再加到酶标板中，常规ELISA试验。
1.4.2 免疫组化试验(IHC) 预先将MS2-pS2融合蛋白分别与抗pS2进口 单抗(DAKO产品)及抗pS2抗血清37 ℃孵育1 h或4℃过夜，再进行常规免疫组化。
1.4.3 Western blotting 诱导菌经15%SDS-PAGE后，将其蛋白转到硝 酸纤维素膜上，用3%BSA37℃封闭0.5 h，将膜分别在无关抗血清及抗pS2抗血清37℃孵育1 h，含0.5%triton x-100的PBS洗3次，加入羊抗小鼠酶标结合物37℃孵育1 h，洗3次，含0.03%H2O2的DAB为底物。阴性对照只加PS2 抗血清或只加羊抗小鼠酶标结合物。
2 结果
2.1 RT-PCR结果 从图1中可以看出，在121 bp之上383 bp之下有一条清 晰条带，与pS2的180 bp分子量相符。
2.2 PMS-pS2重组质粒的鉴定 重组质粒经EcoRI/BamHI双酶切后，在4 k b及200 bp附近分别有1条带，与载体PMS-31b及pS2片段相吻合(图2)。
2.3 MS2-pS2融合蛋白表达及纯化 图3可以看出，诱导菌在18.4 kD 之上比非诱导菌多1条蛋白带，这与MS2-pS2预计分子量基本相符，诱导蛋白以包涵体的形 式存在，而裂解菌的上清中几乎没有；经纯化的MS2-pS2融合蛋白只有1条蛋白带。
2.4 Western blotting 图4中约18 kD附近有1条反应带，其它阴性对 照未出现条带，说明pS2融合蛋白能与抗pS2抗血清特异反应。
2.5 免疫组化试验(IHC) 图5中可以看出进口单抗进行的IHC中，胞浆 有很强的着色，而将pS2单抗或pS2抗血清与MS2-pS2融合蛋白在37℃一起孵育1 h再进行IHC试验时，胞浆几乎没有着色，这说明MS2-pS2融合蛋白能与进口抗pS2单抗、pS2 C-端合成肽多抗特异反应。
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