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雷公藤甲素抑制IL |
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织IL-5 mRNA的表达［1，2］。本文 观察TP对体外人嗜酸性粒细胞(Eosinophil,Eos)凋亡及Fas表达的影响，以进一步阐明TP的 药理作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 人重组(rh)IL-5由美国Genetics Institute(GI)MegO Do nell教授惠赠。Percoll分离液 (Pharmacia)，淋巴细胞分离液(上海生化)，fMLP(Sigma)，T P(福建医学科学研究所)，原位细胞凋亡检测试剂盒(宝灵曼)，Fas抗体(北京中山公司)。
1.2 Eos分离 采用改良的Percoll密度梯度法分离Eos。1.从健康献血者 抽取外周静脉血，枸缘酸钠抗凝。将稀释血液缓慢加在淋巴细胞分离液上面(比重1.077)， 离心1 000 g，20 min。2.取下层粒细胞和红细胞，加入NH4Cl溶液溶解红细胞，离心7 min×400 g。3.沉 淀细胞用Hanks液漂洗，细胞悬浮于5%小牛血清/Hanks液中，37℃，30 min。4.将10 nmol/ L fMLP与细胞悬浮孵育10 min，37℃。5.将细胞悬液缓慢加于Percoll分离液上面，上层比重 1.082，下层比重1.010。离心15 min，1 000 g。6.收集界面细胞，PBS漂洗。分离后细 胞活力和纯度＞97%。
1.3 Eos培养 纯化的Eos悬浮于10%FCS/RPMI 1640培养基，置于96孔平底 培养板，每孔细胞数2.0×105，总体积200 μl。5%CO2，37℃条件下培养。分别加入 不 同浓度IL-5(0.1～100 U/ml)和TP(10-8～10-5 mol/L)，以不加IL-5或 药物作为对照。Eos活力检测采用台盼蓝拒染法，计算存活细胞或死亡细胞百分率。
1.4 原位细胞凋亡检测 参照试剂盒说明略加改进。1.0.3%H2O2/0 .1%NaN3封闭15 min。2.0.1%TritonX-100 4℃通透2 min。3.加入由末端脱氧核苷酸 转移酶(TdT)、脱氧三磷酸核苷(dNTP)和荧光素标记的脱氧三磷酸尿苷(dUTP)组成的混合物3 0 μl，37℃反应60 min。4.过氧化物酶(POD)连接的抗荧光素抗体30 μl，37℃反应30 mi n。 5.显色：加入50 μl显色剂0.06%DAB/0.01%H2O2显色10 min。PBS漂洗终止反应，苏 木 素复染，光镜下观察封片，至少观察5个视野，计数200个细胞以上，计算阳性细胞百分率。
1.5 凋亡DNA电泳 在加入IL-5(1 U/ml)的条件下，TP(10-6 mol/ L)与Eos培养48 h，提取DNA电泳。以新分离的Eos作为对照。主要步骤如下：加入细胞裂 解液0.5 ml(含1 μg/ml蛋白酶K，10 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl,10 mmol/L ED TA,10%SDS)，37℃ 过夜。加入等体积饱和酚抽提。加入等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)再抽提。取上 清，加入1/10体积3 mol/L NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，混匀置-70℃ 10 min。10 0 00 g离心 沉淀DNA，70%乙醇洗涤。样品DNA与上样缓冲液混匀，在含有10 μg/ml溴乙锭的15%琼 脂糖凝胶电泳，紫外线灯下观察照相。
1.6 免疫组化方法检测 IL-5和TP对嗜酸粒细胞Fas表达的影响 新分离 的 嗜酸粒细胞加入IL-5(10 U/ml)，或同时加入IL-5(10 U/ml)与TP(10-6 mol/L)培养 72 h，细胞涂片，4%PFA固定。免疫组化方法参照试剂盒说明，略加修正。主要步骤如下：0 .3%H2O2/ 0.1%NaO23封闭15 min。加入抗Fas多抗37℃孵育1 h。 生物素(Biotin)标记的二抗37℃孵育30 min。链霉亲和素-过氧化物酶溶液37℃孵育30 min 。0.05%DAB溶液显色10 min，常规透明树胶封片。细胞被染成棕黄色者为阳性。
1.7 免疫组化图像分析 将免疫组化图像扫描入920型细胞图像分析仪(重 庆大学)，每张片子至少随机分析5个高倍视野，100细胞以上，计算每个细胞平均积分光密 度值作为该片的Fas相对表达量。染色越深，积分光密度越大，反映Fas表达越高。
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