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Losartan对神经肽Y诱导血管平滑肌细胞增殖的逆转作用 |
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、losartan对体外培养的VSMC中血小板生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、c-myc癌基因表达的影响，从分子生物学的角度探讨NPY在高血压、动脉粥样硬化发生中的作用和losartan的保护作用。
材 料 和 方 法
一、血管平滑肌细胞的体外培养
组织贴块法培养血管平滑肌细胞。无菌条件下分离SD大鼠的胸主动脉，剪碎后加入适量含10%胎牛血清的DMEM(GiBco公司产品)培养液，37℃、5% CO2培养箱中静置培养。用光镜和免疫化学方法进行鉴定。选择生长良好的第6～7代VSMC用于实验。
二、实验分组及NPY、losartan条件培养液的配制
实验分为对照组、NPY组、losartan组和NPY+losartan 组。各实验组分别依次加入NPY、losartan条件培养液各1 mL，对照组为无血清DMEM培养液。NPY(NOVA biochem产品,Switzerland)和losartan (MERCK & CO产品)条件培养液均以无血清的DMEM培养液配制，NPY与losartan终浓度分别为10-6mol/L和10-5g/L。
三、NPY对VSMC增殖和PDGF和c-myc原癌基因表达的影响及 losartan的逆转作用
选择第6代生长良好的平滑肌细胞，消化传代至96孔培养板上，传代细胞密度为5.0×107/L。细胞经18h的预培养和6h的预处理后，将NPY、losartan条件培养液和无血清DMEM培养液加入实验组和对照组，37℃、5% CO2继续培养24 h。吸去培养液，pH 7.3的PBS洗3次，3%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次。
已固定样品按常规免疫组织化学方法处理。首先，5%正常山羊血清封闭，室温孵育30 min；倾去血清，滴加稀释度为1∶50鼠抗大鼠细胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、PDGF和c-myc的单克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品)，4℃冰箱过夜。样品倾去抗体孵育液，PBS洗3次，换加1∶10 FITC荧光标记兔抗鼠抗体(天象人公司产品)，室温孵育40 min后，PBS充分洗板，每待测样品加入20μL PBS后，分别置带电脑激光扫描共焦显微细胞仪(ACAS575UVC型，美国MERIDIAN公司)下,选用40×物镜,7%滤光片,确定激发光波长为488 nm,进入Kinetics-Image Scan程序,预扫描后选定最佳参数,对选定视野扫描并存储所获信息。扫描细胞总数在200个以上。
四、结果分析
进入Kinetics-Image Analysis程序，调出各次实验存储信息，分析并作综合处理，均数间差异显著性用t检验。结果均以±s表示。
结 果
一、血管平滑肌细胞鉴定
倒置显微镜下，细胞生长呈典型的“谷与峰”结构特征，α-actin单克隆抗体免疫细胞化学显示95%为阳性VSMC。
二、NPY对VSMC增殖能力和PDGF、c-myc原癌基因表达的影响以及losartan的逆转作用
将免疫荧光显示技术和带电脑激光扫描共焦显微细胞仪的检测技术结合起来可较为准确地定量细胞中核酸和蛋白质的变化，样品中被检测物质的多少是以其检测物质被荧光标记的平均荧光值来表示。NPY组、losartan组、NPY+losartan组和对照组中PCNA、PDGF和c-myc原癌基因表达的平均荧光值变化见表1。与对照组相比，NPY组中PCNA、PDGF和c-myc的平均荧光值均高于对照组、其中以PDGF表达差异最为明显(P＜0.01)；Losartan组除PDGF外，PCNA、c-myc癌基因表达的平均荧光值与对照组相比明显降低(P＜0.05)。Losartan组与NPY组进行比较， 两者之间显示明显的差异(P＜0.05)，而NPY+losartan组与对照组相比，除PDGF外无明显差异（P＞0.05），见表1。
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