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一条KRAB型锌指蛋白全长新基因的克隆与功能初探 |
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基因编码一条新型的KRAB型ZFP，在染色体上位于19q13.2，命名为ZNF303基因。通过肝癌组织表达谱基因芯片杂交表明，该基因在肝癌组织中的表达量有明显下调。结合该基因的可能的抑制性转录因子功能，我们推论这种表达量的下降可能跟肝癌有密切的相关性。
1 材 料 与 方 法
1.1 cDNA文库的构建与测序
人胎脑Poly A＋RNA购自Clontech公司（Cat.No.6525－1），用SMARTTM PCR（Clontech，Cat.No.K1052－1）方法合成双链cDNA，用pBluescriptⅡSK(＋)(Stratgene)载体构建cDNA文库。挑取cDNA克隆在ABI－377型DNA测序仪上测定全序列。
1.2 生物信息学分析
采用嘉瑞基因数据库分析管理系统对序列进行管理和生物信息学分析，其中，序列拼接采用Assembly，同源比较采用Blast 2.0版，基因数据库采用GenBank、SwissPro和PDB，功能域数据库采用prosite pattern、prosite profile和Pfam。
1.3 RH(radiation hybrid)基因定位
应用辐射杂交细胞系法定位。PCR模板使用Stanford G3 RH 嵌板(Research Genetics公司),操作按说明书进行。引物为ZNF303 5′ATGCAGGAAATCCTTCAACCAGC3′和5′GTGATTTTGAAGCAGGGACGAC3′。PCR的扩增结果送斯坦福大学人类基因组中心(http：//www_shgc.stanford.edu)进行统计分析。
1.4 肝癌组织表达谱基因芯片杂交
肝癌和癌旁正常肝组织由上海长海医院提供，抽取mRNA并用反转录法标记探针。杂交BioDoorTM4000型基因表达谱芯片（United Gene）,杂交参照说明书。用的ScanArray 3000扫描芯片，用ImaGene3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。阳性结果的标准为：Cy3和Cy5信号的比值的自然对数的绝对值>0.69（基因的表达变化在2倍以上），Cy3或Cy5信号值其中之一必须>600。
2 结 果
2.1 ZNF303cDNA的克隆
ZNF303经过Assembly拼接，对获得的2978bp cDNA序列进行分析,该cDNA的337～1770bp是一个完整的开放阅读框，编码478个氨基酸。2911bp处有一个加尾信号（AATAAA）序列（见图1）。将它的cDNA序列送到GenBank的nr数据库进行查新比较并登录，登录号为AF265236。把序列信息送往GDB数据库登录，以ZNF303命名。
2.2 ZNF303推导蛋白质序列的生物信息学分析
Motif分析发现ZNF303280～ZNF303475之间含有7个连续的锌指结构，每两个锌指之间有典型的TGEKPYX结构（见图1）。用Expasy网站（http://www.expasy.ch）的Profilescan分析发现，在ZNF3034～ZNF30366之间有典型的KRAB结构域。
2.3 RH基因定位结果
在ZNF303基因的3′UTR中设计了一对特异的PCR引物，分别以Stanford G3 RH Panel的83个人鼠杂交克隆DNA为模板进行PCR,PCR扩增结果送斯坦福大学人类基因组中心，分析得到3个LOD值大于6的与该定位基因紧密连锁的SHGC Marker,它们在染色体上的位置及与ZNF303基因的距离见表1。人的ZNF303基因定位在D19S425附近，遗传图谱上人的ZNF303基因定位在19号染色体19q13.2区段（见图2）。
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