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白腹锦鸡和红腹锦鸡的遗传分化 |
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9］。
目前DNA序列分析被广泛应用于解决系统发育方面的问题。细胞色素b基因是鸟类分子系统学中最常用的种级水平的分子遗传标记［14］。初步的研究结果显示，细胞色素b基因种间的分歧度为1％～10％，这一分歧度既能区别物种，又可忽略多重替换［15］。我们拟通过比较细胞色素b基因的序列，探讨锦鸡属的种级分类关系。
1 材 料 和 方 法
1.1 材料来源
白腹锦鸡冻存肝脏两份，一份取自中国科学院昆明动物研究所细胞库，一份取自中国科学院昆明动物研究所细胞与分子进化开放实验室。两份样品均采自云南。
1.2 总DNA的提取
肝脏经蛋白酶K消化、苯酚－氯仿抽提及乙醇沉淀后得到总DNA ［16］。总DNA用GeneQuant II (Pharmacia)定量后稀释备用。
1.3 细胞色素b基因的扩增及序列测定
进行PCR反应及测序所用的引物为L14851(5′－ tacctgggttccttcgccct－3′)、H15298(5′－ aaactgcagcccctcagaatgatatttgtcctca－3′)［17～18］和我们设计的 L15218(5′－ cctatactatggctcctacct－3′)、H15754(5′－ gctagtacgcctccgagttt－3′)。进行PCR反应时，每25μl反应体积内含10×buffer 2.5μl、dNTP混合液1μl(浓度分别为2.5mmol/L)、两条引物各为0.5μl (浓度分别为10pmol/L)、Tag DNA聚合酶0.25μl(1.25U)(华美)及10ng总DNA，用去离子水补充至25μl。PCR反应在TRIO－ThermoblockTM (Biometra)上进行，共运行35个循环。每一循环包括：94℃变性40s,53℃退火50s,72℃延伸50s。第一次循环前于95℃预变性2min，最后一次循环后于72℃延伸5min。
PCR产物经W5212柱离心式胶回收试剂盒(华舜)纯化后作测序反应的DNA模板。所用Kit为BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin－ Elmer)。测序反应依Kit说明书上推荐的条件进行。测序反应产物经Sepha dex○ G－50柱(ICN Biomedicals Inc.)纯化后，用ABI 377全自动测序仪(Perkin －Elmer)进行正反链双向测序。
1.4 数据分析
用DNASTAR(DNASTAR Inc.)进行同源序列排列，用MEGA［19］进行转换与颠换数目的统计、基于木村资生双参数法的遗传距离的计算。物种分歧时间用T=K/2r进行计算［20］，T代表两个物种的分歧年代，K代表细胞色素b基因每一位点的平均同义突变数，r代表每个位点每年的同义突变速率。
2 结 果 和 讨 论
实验共获得了白腹锦鸡两个个体各861bp、且完全相同的细胞色素b基因序列。这些序列对应287个氨基酸。与红腹锦鸡的同源序列(Genbank AF028793)相比，相似率为在21个位点上出现差异(图1)。所有的序列变异均发生在三联体密码子的第3位，且全为转换，未发现颠换。
根据鸡形目细胞色素b基因核苷酸替换的速率约为每百万年0.5％～ 0.7％［21］，计算出白腹锦鸡与红腹锦鸡的分化发生在1.7百万年～2.4百万年。用木村资生的双参数法基于细胞色素b基因序列计算出白腹锦鸡与红腹锦鸡的遗传距离为2.5％。搜索GenBank后，我们得到9条相关的鸡形目细胞色素b基因序列，即石鸡属7个种的序列：须石鸡(Alectoris barbara) (Z48771)、石鸡(Alectoris chukar) (L08378)、欧石鸡(Alectoris graeca) (Z48772)、大石鸡(Alectoris magna)(Z48776)、阿拉伯石鸡(Alectoris melanocephala) (Z48773)、菲尔比氏石鸡(Alectoris philbyi) (Z48774)、红脚石鸡(Alectoris rufa) (Z48775)，孔雀属2个种的序列：绿孔雀(Pavo muticus) (AF013763)、蓝孔雀(Pavo cristatus) (L08379)。用同样的方法,计算出石鸡属和孔雀上一页 [1] [2] [3] 下一页
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