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雌核发育银鲫与两性生殖彩鲫卵壳蛋白组分的比较分析及其受精前后的变化 |
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而且将为最终阐明银鲫卵子抑制精核发育的调控机制提供有价值的资料。
本次实验以D系和F系银鲫为实验材料，在建立并完善卵壳分离及可溶性蛋白提取技术的基础上，对卵壳可溶性蛋白组分进行了凝胶电泳分析。通过与两系亲缘种彩鲫卵壳蛋白组分的比较，初步观察到银鲫卵壳的差异蛋白，并对这些蛋白在受精过程中的变化进行了分析。
1 材 料 和 方 法
1.1 材料鱼
本实验所用材料鱼均取自本所关桥实验养殖基地，其卵子经人工催产获得。银鲫包括D系和F系两个雌核发育系［8］，其受精后卵子由红鲤精子刺激雌核发育而获得。水晶彩鲫的受精卵由水晶彩鲫雄鱼精子自交授精而获得。
1.2 卵壳的分离和纯化
所有操作在4℃下进行。取成熟卵细胞置于含0.1％Triton×－100,1mmol/L PMSF的TNE溶液(50mmol/L Tris－HCl 0.6％NaCl,5mmol/L EDTA)中， 轻微匀浆使卵细胞中内容物自卵壳逸出。将匀浆液轻铺于1mol/L蔗糖溶液（用TNE溶液配制）上层，自然沉降10～20分钟。取下层卵壳用预冷TNE溶液反复洗涤至上清液清亮，光镜检测所制得卵壳的纯度［9］。
1.3 未受精卵卵壳可溶性蛋白的提取分离
取所获得纯净卵壳置于含0.1％Triton×－100的TNE溶液中［10］，4℃孵育20分钟后以3500g离心10分钟，弃上清。再用预冷的TNE溶液清洗沉淀三次，转入S－TNE(0.6mol/L NaCl,1mmol/Lβ－巯基乙醇，0.1％Triton X－100)溶液中，精细匀浆至不再可见卵壳结构，溶液呈悬浊状态。18 000g离心20分钟，所得上清即为卵壳可溶性蛋白，－20℃保存以备进行SDS－PAGE胶检测。
1.4 受精卵卵壳可溶性蛋白的提取分离
将成熟卵细胞排于洁净干燥的瓷盘内，与对应组合雄鱼精子进行干法受精，入水开始计时。在受精5分钟时，分别取D系、F系银鲫和彩鲫受精卵经筛绢过滤，转入含0.1％Triton X－100，1mmol/L PMSF的TNE溶液中，终止发育。随即匀浆，其后卵壳的分离与卵壳可溶性蛋白的制备过程同前。此外，对F系银鲫受精卵又分别在发育10、20、30、40、50和60分钟时取样进行同样处理，获得各对应发育时刻的卵壳可溶性蛋白。每一受精组合留一定量受精卵继续发育至孵化期，统计受精率。
1.5 SDS－PAGE梯度凝聚电泳分析
6％～15％SDS梯度凝胶参照朱蓝菲［11］以及Gui等人［12］的方法制备，在10℃下进行电泳。样品在浓缩胶时的电压为100V，进入分离胶后，电压调整为180V，继续电泳3.5个小时。电泳结束后，采用0.25％考马斯亮蓝R－250进行显色，在脱色液中脱色至条带清晰后于7％醋酸溶液保存。
2 结 果
2.1 未受精卵壳蛋白的SDS－PAGE电泳分离
分离纯化的卵壳通过匀浆抽提出的可溶性蛋白经6％～15％SDS－PAGE梯度凝胶分离后，其电泳图谱上的大多数蛋白带在银鲫和彩鲫之间基本相近（图1，A）。经详细比较后发现，D和F两个雌核发育系银鲫间的蛋白谱带基本一致，而与两性彩鲫相比，有几条蛋白带存在明显差异。如银鲫在190kDa处蛋白带的迁移率稍快于彩鲫的对应谱带；在29kDa处，银鲫较彩鲫明显多出1条带；此外，在22kDa处，银鲫呈现有一条清晰的带纹，而在彩鲫的对应位置则未见到带纹。将卵壳抽提后沉淀下来的不溶性部分再经SDS－PAGE胶电泳分离后，虽还可观察到许多抽提液中所没有的蛋白带，但这些带纹在雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫之间看不出差异（图1，B）。因而可以认为，在银鲫和彩鲫卵壳中，存在有分子量约为190kDa、29kDa和22kDa等几种可溶性的差异蛋白。
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