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应用铈细胞化学方法观察镉诱发氧自由基对肾脏的损伤 |
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察。
EDAX9100能量色散谱仪分析样品制样稍有不同，即超薄切片用200目的覆有Farmavr膜的镍网收集，直接经EDX分析。
结果
实验A组近曲小管上皮细胞底部近基膜处有Ce H2O2的反应沉淀物。基膜外侧内皮细胞亦有大量的Ce-H2O2反应沉淀物，同时内皮细胞与基膜有分离现象（图1）。部分内皮细胞完全脱落，近曲小管上皮细胞线粒体周围、基膜及内皮细胞表面均有Ce-H2O2的沉淀物（图2）。近曲小管上皮细胞顶部微绒毛有Ce-H2O2的沉淀物（图3A）。实验B组可见微绒毛已有紊乱现象(图3B)。近曲小管上皮细胞顶部胞质出现较大的多泡体（图4）。EDX点分析表明，多泡体内Cd的Lα及Lβ峰(图5），细胞膜以及胞质内EDX点或面分析有短暂的Cd峰出现，但无法稳定收集。远曲小管上皮细胞底部及肾小球毛细血管内皮细胞均有不同程度的Ce-H2O2沉淀，并伴有内皮细胞与基膜间隙增大倾向。除H2O2大量形成外，内皮细胞膜脱落较A组明显增多。从A、B两组实验结果观察，内皮细胞的Ce-H2O2的沉淀为最多，肾细胞的超微结构除发现细胞及线粒体肿胀外未发现显著病理变化。正常对照组未发现Ce-H2O2的明显沉淀物。
图1 血管内皮细胞与基膜已分离，并有Ce-H2O2的反应沉淀（×25000） 图2 线粒体、基膜及内皮细胞均有大量Ce-H2O2的反应沉淀（×20000）
图3A 微绒毛处有Ce-H2O2的反应沉淀
图3B 微绒毛已出现紊乱现象（×20000） 图4 近曲小管小皮细胞胞质出现较大的多泡体（×25000）
图5 EDX检测多泡体内有Cd峰显示
讨论
活性氧簇包括超氧阴离子（O-2）、羟自由基（OH·）、过氧化氢（H2O2）等［4，5］导致细胞膜及细胞器膜的蛋白、脂质过氧化，从而影响细胞的粘附，能量代谢，细胞膜的通过性及滤过屏障的功能等。目前已知铁盐或Fe2+可催化体内最强促氧化剂OH·的大量形成。如从O-2+H2O2→OH·+O2，H2O2+Fe2+→Fe3++OH-+OH·，以及H2O2易发生均裂形成OH·。促氧化剂H2O2除本身具有氧化作用外其过量的产生，可导致OH·的大量形成。进一步加剧蛋白质及脂质的氧化损伤。我们应用Ce离子捕捉H2O2，生成Ce(OH)2OOH或Ce(OH)3OOH沉淀，观察Cd诱发的氧自由基对肾脏的急性损伤。由于自由基半寿期短，只能与其临近生物分子发生反应（特异位置机理）。结果表明，急性Cd中毒时，以近曲小管上皮细胞、内皮细胞、肾小球毛细血管内皮细胞的质膜自由基损伤最为明显。将导致肾细胞的氧化应激，尤其是蛋白质、脂质的过氧化使细胞之间粘附力减弱，使内皮细胞易于脱落以及线粒体内外膜上存在复杂的酶系，质膜的损伤将影响其能量代谢的过程。进而影响肾脏重吸收、滤过功能，继发一系列的临床病变。我们还发现肾小管上皮细胞底部与基膜连接处亦有Ce-H2O2的沉淀物，如果此处的自由基损伤持续存在将影响肾小管上皮细胞与基膜的粘附能力，最终可能导致上皮细胞的脱落，引发更为严重的后果。肾小管上皮细胞顶部多泡体增多及Cd的相对浓度高现象，可能与Cd的细胞吞噬或胞饮有关。结果提示,急性Cd中毒可能首先诱发肾细胞氧自由基大量生成，造成细胞蛋白质及脂质过氧化。而损伤最初及严重的部位是作为滤过屏障的内皮细胞、基膜、毛细血管内皮细胞。另一方面，Cd可能抑制了肾细胞过氧化氢酶，SOD等酶类的活性，使机体淬灭O-2及H2O2的能力减弱等综合因素所造成的氧化应激损伤，有待进一步研究。
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