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恙螨体内出血热病毒检测增殖及其定位 |
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R缓冲液、dNTPs和Taq酶均为上海复旦大学产品。DNA标准分子量(Marker)为pGEM-7zf(+)／HaeⅢ DNA Markers，上海华美公司产品。HTN病毒S基因cDNA质粒PG34和A9株TA9MIB质粒由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。地高辛标记检测试剂盒为德国Boehringer mannhein公司产品。英国Bight冷冻切片机。
二、方法
1.恙螨体内HFRSV检测研究：恙螨RNA模板制备和逆转录PCR扩增反应见文献［2］。
2.恙螨体内HFRSV增殖研究：鼠体恙螨HFRSV和小黑板采集的游离恙螨HFRSV增殖观察见文献［3］。
3.恙螨体内HFRSV定位研究：核酸探针制备:取PG34及A9株TA9MIB质粒，用华美生物工程公司PCR核心系统和Boehringer mannhein探针标记试剂盒扩增制备576 bp S基因属特异性和215 bp M基因型特异性cDNA探针。产物经酚、酚／氯仿、醋酸钠乙醇抽提沉淀，真空干燥，加入六聚核苷酸混合物2 μl,dNTPs标记混合底物(1 mmol/L dATP、1 mmol/L dCTP、1 mmol/L dGTP、0.6 mmol/L dTTP、0.35 mmol/L DIG-duTP)2 μl, 无菌双蒸水加至19 μl，DNA聚合酶I大片段1 μl(2 μl)，总反应体系20 μl。短暂离心，37℃过夜，煮沸5分钟终止反应，加12 μl 4 mol/L Licl,200 μl 95％预冷乙醇-20℃过夜。12 000 g离心15分钟,75％乙醇洗涤,10 000 g 5分钟真空干燥,溶于-20 μl TE液中-20℃保存备用。Dig标记探针结果及浓度测定见文献［3］。原位分子杂交参照文献［4，5］。
结果
一、 恙螨体内HFRSV RNA PCR检测
取小黑板采集的游离恙螨幼虫和饲养出的若虫,制备螨悬液提取RNA，分别经逆转录、扩增、检测。结果6份小黑板采集的游离恙螨幼虫和饲养出的若虫有4份扩增后见到215 bp的DNA扩增带(分别为40天组、80天组、100天组和若虫组)。表明恙螨幼虫、若虫体内有HFRSV RNA。
二、恙螨体内HFRSV增殖
1.幼虫HFRSV增殖:除60天组外，其余各组均测出，鼠肺HFRSV抗原阳性鼠体恙螨幼虫滴度均较HFRSV抗原阴性鼠体恙螨幼虫和小黑板采集的游离恙螨幼虫高10-1以上。
2.若虫HFRSV增殖:除鼠肺HFRSV抗原阴性鼠体恙螨若虫未测出外，抗原阳性鼠体恙螨幼虫、小黑板采集的游离恙螨幼虫孵出的若虫均测出（表1）。
表1 不同时期小盾纤恙螨HFRSV TCID50测定
标本分类 编号 采集至测定
间隔天数 测定用
螨数(只) TCID50/ml
(直接测定)
HFRSV抗原阳性 幼虫 LS1 20
100
10-1
鼠体恙螨 LS2 40 100 10-2
60 100 -
LS3 80 100 10-4
LS4 100 100 10-5
若虫 LS5 100 6 10-6
HFRSV抗原阴性 幼虫 LS6 20 100 10-1
鼠体恙螨 LS7 40 100 10-2
60 100 -
LS8 80 100 10-4
LS9 100 100 10-5
若虫 100 7 -
小黑板诱集的 幼虫 LS10 20 100 10-1
游离恙螨 LS11 40 100 10-2
60 100 -
LS12 80 100 10-4
LS13 100 100 10-4
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