|
甲基叔丁基醚对大鼠肝组织基因表达的影响 |
| |
，减少一氧化碳(CO)和其他一些有害物质的排放，并可替代铅用作汽油抗爆剂。目前在世界上已得到广泛应用［1］。现有研究表明，MTBE的Ames试验为阴性，但在部分动物致癌试验中呈阳性结果。有关其动物致癌的机制目前尚不清楚。为此，我们观察了经MTBE亚慢性染毒后，大鼠肝细胞中原癌基因c-myc基因和功能基因谷胱甘肽S-转移酶P（GST-P）基因的表达情况。已知这些基因在细胞中受到某些化学致癌因子作用后，会在细胞中高表达，则细胞在以后的演变中可能形成肿瘤。
材料与方法
1．试剂和材料：MTBE（上海炼油厂提供，纯度98.8％）；2-巯基乙醇，异硫氰酸胍（Sigma公司产品）；琼脂糖（华美公司）；RNA酶（Merck），限制性内切酶EcoRⅠ，SalⅠ(Promega)；地高辛标记检测试剂盒（Boehringer Mannheim）。尼龙膜（Boehringer Mannheim）。
2．实验动物及处理：雄性SD大鼠，体重180～200 g，由本校实验动物中心提供。动物随机分成4组，每组10只。将MTBE溶于豆油中，灌胃染毒，染毒剂量分别为200 mg/kg，600 mg/kg，1 000 mg/kg，对照组给予等量豆油。1天1次，每周5天，共13周。各组动物于末次染毒后24小时处死，迅速取出肝脏（部分），液氮中速冻后-70℃保存。
3.探针的制备：含GST-P基因片断的PGP5质粒(由中国医学科学院基础医学研究所左瑾惠赠)。GST-P基因片断两端限制性内切酶的位点为EcoRⅠ和SalⅠ，片断长0.72 kb。质粒的扩增、抽提、纯化及回收均按文献方法进行［2］。c-myc探针（华美公司）片断长0.85 kb。随机引物法地高辛标记探针。
4．RNA的提取和点杂交：分别合并各剂量组动物肝脏，置于液氮中研磨后，1 g组织加10 ml溶液(4 mol/L异硫氰酸胍；25 mmol/L柠檬酸钠，pH 7.0；0.5% Sarcosyl；0.1 mol/L 2-巯基乙醇)制成匀浆，一步法提取总RNA［3］。RNA样品在分光光度计上进行定量。样品变性后，根据点样量大小设两个剂量，分别按每孔10 g及30 g RNA点膜。所用探针浓度为125 g/ml。经预杂交、杂交，洗膜，封闭，最后避光显色8小时，颜色紫蓝色判断为阳性。各孔颜色深浅用ImageMaster VDS Software (phamacia biotech)进行图像分析，计算mass值。
结果
MTBE增强了大鼠肝组织c-myc基因的表达活性。点杂交结果显示（图1，2），各剂量组肝组织中c-myc基因均呈高表达，且有一定的剂量关系。而GST-P基因的表达未见增高。
由左至右，各孔分别为：第一排：
10 μg RNA低剂量组 中剂量组 高剂量组 对照组 探针
mass 1.117 0.917 6.247 1.000 3.380
第二排：30 μg RNA低剂量组 中剂量组 高剂量组
mass 3.496 6.187 6.863
图1 大鼠肝组织RNA c-myc基因点杂交图
由左至右，各孔分别为：第一排：
10 μg RNA低剂量组 中剂量组 高剂量组 对照组 探针
mass 0.604 0.848 0.789 1.000 6.201
第二排：30 μg RNA低剂量组 中剂量组 高剂量组
mass 0.549 0.482 0.658
图2 大鼠肝组织RNA GST-P基因点杂交图
讨论
c-myc基因和细胞周期有着密切关系，它的表达高低与细胞分裂的速度有关，在静止和终末分化的细胞中表达很低，而在有丝分裂剂的刺激下可显著增高，因此c-myc基因被称为可使细胞“永生化”的癌基因［4］。它的表达产物是一种核蛋白，能影响基因转录和DNA复制，是调节细胞增殖和分化的关键物质之一［5］。c-myc基因的高表达可促进细胞增殖，抑制细胞分化。增殖细胞中c-myc基因的表达活性通常高于静止细胞。将c-myc蛋白显微注射于静止细胞中可诱导DNA合成，并可使静止的细胞进入细胞周期［6］。在多阶段致癌过程中，c-myc基因的失调是必需的步骤。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 甲基汞对大鼠胚胎细胞毒性和相关基因表达的影响
下一个医学论文： 酒精代谢酶基因型在日本双生子中的分布
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文