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甲基汞对大鼠胚胎细胞毒性和相关基因表达的影响 |
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behavior and related gene expression played important roles in developmental toxicity caused by methylmercury.
【Key words】 Methylmercury compounds Fetal development Apoptosis Gene expression
大量的流行病学调查和动物实验结果均已肯定甲基汞是人类致畸原［1，2］，但至今对其发育毒性作用机理仍不十分清楚。本实验采用短期体内/体外动物模型，研究甲基汞对大鼠胚胎细胞行为和相关基因表达变化的影响，为深入探讨甲基汞发育毒性作用机理提供有价值的参考模型和依据。
材料与方法
一、材料
1.实验动物：二级SD大鼠，雌鼠体重(260±30) g，合笼交配后查见阴栓日定为妊娠0天，第9天14∶00时定为妊娠9.5天。
2.试剂：氯化甲基汞为日本产分析纯，地高辛精（Dig）标记检测试剂盒购于美国Promega公司，细胞凋亡检测试剂盒购于德国宝灵曼公司，互补DNA （cDNA）包括肿瘤抑制基因（p16 cDNA）、热休克蛋白（HSP70）由美国加州大学Ruigiong R博士惠赠，纤维连接蛋白互补DNA（FN cDNA）、焦碳酸二乙酯（DEPC）、蛋白酶K、十二烷基肌酸钠、多聚甲醛等试剂均购自华美公司。
二、方法
1.实验分组：体外实验分7组，自制培养基中甲基汞的质量浓度依次为0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80和1.60 mg/L；体内实验分6组，一次性腹腔注射甲基汞，剂量依次为0、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 mg/kg。
2.体外全胚胎培养和评价方法：见文献［3］。
3.体内器官形成期胚胎检测：于妊娠11.5天处死孕鼠，剖腹，分离胚胎，评价方法同体外评价法一致。
4.细胞凋亡（程序性细胞死亡，PCD）原位检测：见文献［4］。
5.原位杂交（ISH）检测：参照说明书制备HSP70、FN和p16 cDNAs探针。在无RNA酶和无菌的环境条件下，将大鼠胚胎制成冰冻切片。经蛋白酶K、甘氨酸、DEPC等处理后，用4％多聚甲醛进行后固定和预杂交。然后滴加杂交液（预杂交液中加已变性的Dig标记cDNAs探针），湿盒中42℃杂交过夜。系列SSC漂洗，Buffer处理后加碱性磷酸酶标记羊抗地高辛Fab片段。洗片，NBT/BCIP避光室温显色，Buffer Ⅳ终止反应，甘油明胶封片。以杂交前用RNA酶（100 μg/ml）处理、杂交液中不加标记的探针作为阴性对照。
6.病理检查：胚胎（每剂量组3～4只）经固定、脱水、定位石蜡包埋、整体连续切片、脱蜡后，以甲基绿-派若宁染色显示胚胎细胞核酸变化；以HE染色观察胚胎组织结构。另取部分胚胎和卵黄囊胎盘（yolk sac placenta，YSP）按常规方法制成电镜标本。
7.统计学处理：用SAS软件进行方差分析和趋势性χ2检验等。
结果
1.甲基汞对9.5天龄大鼠胚胎的致畸作用：随体外/体内染毒剂量增加，活胚胎数明显减少，发育迟缓和畸形发生率明显升高，均呈剂量-反应关系（表1）。畸形的主要表现是神经管未闭、小头、体位异常及肢芽小等。
表1 甲基汞对大鼠胚胎发育的毒性作用
组别 活胚胎
(%)** 卵黄囊血管
分化得分 卵黄囊直径
(mm) 胚胎干重
(mg) 颅臀长
(mm) 头长
(mm) 发育迟缓
(%)** 畸形
(%)**
体外(mg/L)
0 100(36/36)
3.90
4.94
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