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镍和镉对人外周血淋巴细胞的DNA损伤作用 |
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nt role in carcinogenesis and mutagenesis.
【Key words】 Nickel Cadmium DNA damage NAD+ADP-ribosyltransferase
关于镍和镉的遗传毒性以及对DNA的损伤作用已众所周知。DNA双链断裂比单链断裂更不易修复，并可直接引起染色体畸变和微核。DNA-蛋白质交联(DPCs)可影响基因表达，破坏染色体结构，甚至由于它比较难修复，在DNA合成的过程中，可造成某些重要的基因丢失，但其检测通常都要用同位素，这就给它的应用带来一定局限性。而将DNA单链、双链断裂和DNA-蛋白质交联等多项DNA损伤生物标记综合起来评价毒物的遗传毒性，目前尚未见报道。聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶(PARP)是广泛存在于真核细胞内的核酶,它可被DNA断裂激活,催化合成与多种靶蛋白共价结合的聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合体,从而改变核内多种酶和结构蛋白的活性,使DNA修复能够快速而准确地进行［1］。本研究应用简便、快速、敏感、非放射性的单细胞凝胶电泳(SCGE)方法，检测了镍和镉在体外染毒情况下，对人外周血淋巴细胞的致DNA单链、双链断裂和DNA-蛋白质交联作用，同时用简便的方法测定了PARP酶活性的变化，为寻求简便、价廉、省时和可靠的DNA损伤生物监测方法提供线索。
材料与方法
1.细胞的获得及染毒：用常规方法从健康成年男性全血(广州市血液中心提供)中分离淋巴细胞，用Tris缓冲盐溶液(25 mmol/L Tris碱、0.8% NaCl、0.02% KCl、pH值7.4)(TBS)制备2×106/ml的细胞悬液,锥虫蓝测定细胞存活率。用1.5 ml塑料离心管分装细胞悬液0.5 ml/管，分别加入10 μl NiCl2和CdCl2各浓度染毒应用液，使染毒终浓度分别为：NiCl2 0.10、0.40、2.00和10.00 μmol/L，CdCl2 0.16、0.80、4.00和20.00 μmol/L；阳性对照组加10 μl甲基磺酸甲酯(MMS),阴性对照组加10 μl三蒸水，37℃温育30分钟。染毒完毕用TBS洗细胞3次，以除去毒物。之后也用锥虫蓝测细胞存活率。
2.单细胞凝胶电泳测定DNA损伤：用本室已建立的方法进行DNA单链断裂测定［2］。用文献［3］的方法检测DNA双链断裂。根据本室测定DNA单链断裂的SCGE方法和贺福初碱洗脱法测DPCs的原理和步骤［4］，略作改进后进行DPCs的测定：制片和裂解同DNA单链断裂测定，裂解后的玻片用1 mmol/L EDTA*Na2洗净表面残留的裂解液，滴干液体后，在每块胶上滴加50 μl蛋白酶K（德国Merk公司）作用液(1 mg/ml，用不含Triton X-100的裂解液配制），每个样本另有一块胶滴加50 μl不含Triton X-100的裂解液作为对照，盖上盖片后37℃培养箱中作用2小时，以后再按测定DNA单链断裂的SCGE方法进行电泳、染色和观察,该法已由本室用交联剂甲醛证实了其可靠性。以上DNA单链断裂、双链断裂和DNA-蛋白质交联的测定可同时进行，但必须分别制胶。
3.PARP酶活性的测定：采用文献［5］的方法，［4-3H］NAD为英国Amersham公司产品, 酶活性以DPM/106细胞为单位。
4.数据统计分析：SCGE得出的“彗星”尾长以频数表形式记录，以均数±标准差表示，由于方差不齐，用秩和检验分析对照组与染毒组尾长的差别及各毒物不同浓度之间尾长的差别，用列联表的Pearson相关分析毒物浓度与尾长的相关关系；PARP酶活性测定结果也以均数±标准差表示，由于计数率偏低，用Poisson分布检验各组液闪计数的差异。
结果
1.存活率测定：染毒前后，对照组和各染毒组的存活率均不低于95%，且差异无显著性。
2.DNA损伤测定结果(表1,2)：
上一页 [1] [2]
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